高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

韩萌萌，盖金明，姜庆丰，张 会，李 杰

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

果胶甲酯酶对果胶分子中的甲酯基团具有高度专一性，可以将其催化水解形成果胶酸，并释放氢离子和甲醇。由于具有这一特性，果胶甲酯酶在工业当中得到广泛的应用[1−2]。果胶甲酯酶可以将高酯果胶变成低酯果胶，低酯果胶是具有较高价值的工业原料[3]，低酯果胶还可作为药物的组成成分，加快伤口愈合，减少血浆中的胆固醇。目前生产低酯果胶的最佳方法是果胶甲酯酶法生产，而低酯果胶产品的品质高度依赖于果胶甲酯酶制剂的纯度[4−6]。果胶甲酯酶还应用于造纸工业的白水处理[7−8]，在饲料工业中它与其他酶系复合使用还可以提高饲料转化利用率[9]。此外由于果胶甲酯酶在罐头、果汁、泡菜等食品行业有较多的应用[10−12]，因此，食品级果胶甲酯酶的需求量也在逐年增加，食品级果胶甲酯酶商品纯度的要求也很高[13−14]。

目前市面上销售的果胶甲酯酶多为黑曲霉发酵生产[15]，而黑曲霉在发酵生产果胶甲酯酶的过程当中还同时分泌许多其他酶类，这就导致了在下游分离纯化果胶甲酯酶的过程当中产生产量的损失以及酶活的损耗[16−17]。同时分离纯化的工艺步骤也大大增加了产酶的成本，使得果胶甲酯酶的价格较高，并且目前果胶甲酯酶的分离纯化工艺也并不完善，最终的产品纯度也得不到保证[18]，这对于一些高度依赖于果胶甲酯酶纯度的产品的生产是不利的。所以，获得高产高纯度果胶甲酯酶的工程菌具有重大的商业价值[19−20]。

本实验从果胶酶生产菌株黑曲霉种克隆了果胶甲酯酶基因pmeA，构建了由PglaA6R启动子和SglaA信号肽调控的表达载体pSZHG6R-pmeA，通过农杆菌介导法转化糖化酶生产菌黑曲霉TH-2，获得高效分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。进一步通过敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中的asaA基因和优化发酵培养基，去除了背景蛋白，从而获得了高产高纯度果胶甲酯酶的工程菌。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉TH-2、黑曲霉果胶酶生产菌、农杆菌AGL1、AGL1（pSZH-ΔpyrG）、AGL1（pSZHA-pyrG），大肠杆菌DH5α、载体pSZHG6R 由真菌遗传研究室保存；限制性核酸内切酶、T4DNA Ligase Takara公司；基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 康为世纪公司；利福平、卡那霉素、氨苄霉素、乙酰丁香酮、PCR引物（表1） 生工生物公司。

表 1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequence

PCR仪 杭州晶格科学仪器有限公司；T960型热循环仪、SDS-PAGE电泳系统 美国伯乐生命医学产品有限公司；Mini-PROTEAN® Tetra蛋白质电泳系统、凝胶成像系统 上海天能科技有限公司；Tanon 2500R全自动数码凝胶图像分析系统、控温水槽 上海博迅实业有限公司；DK-8D三温三控水槽、紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司； UV-5800PC型紫外可见分光光度计、恒温振荡培养箱美国精骐科技与产业有限公司；IS-RDD3型台式恒温振荡器、高压蒸汽灭菌锅 美国致微仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果胶甲酯酶基因的扩增 依据黑曲霉pmeA基因组序列（Gene ID: 4980618），应用软件DNAMAN8.0设计用于扩增去除分泌信号肽编码序列的pmeA基因引物P1、P2。提取黑曲霉果胶酶生产菌的基因组，用引物P1、P2进行PCR扩增，基因组提取实验步骤和PCR扩增实验步骤参照文献[21]，回收约1300 bp的目的条带，克隆测序，将测序正确的质粒命名为pMD-pmeA。

1.2.2 表达载体的构建 用XbaⅠ和HindⅢ双酶切质粒pMD-PmeA，回收约1300 bp的pmeA基因片段。用NheⅠ和HindⅢ双酶切实验室保存的pSZHG6R载体，回收载体片段。用T4DNA Ligase将这两个片段23 ℃连接2 h，随后将其转化到大肠杆菌DH5α中，过夜培养，挑取单菌落提质粒，XbaⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表达载体pSZHG6R-pmeA是否构建成功。

1.2.3 冻融法转化农杆菌 用冻融法将表达载体pSZHG6R-pmeA转入农杆菌AGL1中[22−23]，用引物P3、P2进行菌落PCR鉴定。

1.2.4 黑曲霉转化和纯合转化子鉴定 取匀浆后的新鲜黑曲霉TH-2菌丝与活化后的农杆菌AGL1（pSZHG6R-pmeA）菌液各150 μL混合，涂布在贴玻璃纸的固体PDA平板培养基上，30 ℃恒温培养。待长出菌落，将玻璃纸及其上菌落翻转倒扣在添加300 μg/mL潮霉素的 PDA平板上进行筛选。30 ℃培养1 d后，将玻璃纸揭下，继续30 ℃恒温培养。待上述培养皿长出菌落，挑取至添加300 μg/mL潮霉素的 PDA液体培养基中，30 ℃静止培养3~6 d，取菌丝提取基因组DNA。以TH-2基因组DNA为模版，用引物P3、P4进行PCR扩增，将PCR产物用HindⅢ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳[22−23]。获得的纯合重组菌株命名为TH-2（glaA::pmeA）。

1.2.5asaA基因的敲除 首先根据同源重组的原理敲除TH-2（glaA::pmeA）中的pyrG基因。将黑曲霉TH-2（glaA::pmeA）与农杆菌AGL1（pSZH-ΔpyrG）共培养。筛选培养基为含5-FOA和尿苷的CD培养基，用引物P5、P6进行鉴定，其他方法和步骤同1.2.4。获得的纯合重组菌株命名为TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）。

然后根据同源重组的原理敲除TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）中的asaA基因。将黑曲霉TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）与农杆菌AGL1（pSZHA-pyrG）进行共培养。筛选培养基为CD培养基，用引物P7、P8进行鉴定，其他方法和步骤同1.2.4。获得的纯合重组菌株命名为TH-2（glaA::pmeAΔpyrGasaA::pyrG）。

1.2.6 SDS-PAGE 取新鲜的黑曲霉菌株，接种于100 mL液体发酵培养基（玉米浆20 g/L，豆饼粉30 g/L，葡萄糖100 g/L）中，30 ℃，200 r/min培养。将3~9 d的发酵上清液10 μL与10 μL的2×Protein loading buffer混合，沸水浴5~8 min使其中蛋白质变性。以Protein marker作为对比，将3~9 d发酵上清液进行SDS-PAGE检测，浓缩胶电压为100 V，分离胶电压为120 V。电泳结束后用考马斯亮蓝过夜染色，后用脱色液脱色4~6 h。

1.2.7 果胶甲酯酶酶活的检测 取3~9 d重组菌株TH-2（glaA::pmeA）或TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的发酵上清液测定果胶甲酯酶酶活。酶活定义为：在50 ℃，pH8.5的条件下，1 mL酶液每分钟催化果胶水解生成甲醛的μmol数为一个酶活力单位，即1 U。具体检测方法参照文献[18]。

1.2.8 果胶甲酯酶酶学性质的检测 将重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）进行发酵培养，取第6 d的发酵上清液，在pH区间3~8.5范围内，以0.5为梯度逐一进行果胶甲酯酶酶活检测，对比不同pH条件下，果胶甲酯酶酶活的变化情况。在温度区间为20~80 ℃范围内，以10 ℃为梯度逐一进行果胶甲酯酶酶活检测，对比不同温度条件下，果胶甲酯酶酶活的变化情况。

2 结果与分析

2.1 果胶甲酯酶pmeA基因的克隆

提取果胶酶生产菌的基因组，用基因特异性引物P1、P2克隆出1267 bp的果胶甲酯酶基因pmeA如图1所示。将此条带与pMD-19T连接并转入大肠杆菌DH5α中，提取大肠杆菌质粒。将测序得到的质粒序列进行Blast比对，结果表明此序列与Gene ID: 4980618的序列相似性为100%。

2.2 表达载体pSZHG6R-pmeA的构建

用基因特异性引物P1、P2克隆出1347 bp的果胶甲酯酶基因pmeA。回收目的基因并与pMD-19T载体相连，转入大肠杆菌受体中，进行大肠杆菌质粒的提取，得到质粒pMD-pmeA，并用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，可切出大小为1347 bp和2700 bp的片段，将双酶切回收的pmeA基因片段与pSZHG6R载体连接。提取转化子的质粒，用XbaⅠ和HindⅢ对其进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图2所示，1号泳道显示出2条条带，分别约15000 bp和4000 bp，证明表达载体pSZHG6RpmeA构建成功。

图 1 pmeA基因扩增结果Fig.1 Cloning of pmeA by PCR

图 2 pSZHG6R-pmeA双酶切鉴定结果Fig.2 Identification results of pSZHG6R-pmeA double digestion

2.3 冻融法转化农杆菌

表达载体pSZHG6R-pmeA冻融法转化农杆菌的菌落PCR鉴定结果如图3所示，1号泳道与质粒pSZHG6R-pmeA的阳性对照泳道扩增条带大小相同，证明表达载体pSZHG6R-pmeA成功转入农杆菌中。

图 3 表达载体pSZHG6R-pmeA转化农杆菌的菌落PCR结果Fig.3 Colony PCR results of expression vector pSZHG6RpmeA transformed into Agrobacterium tumefaciens

2.4 过表达pmeA纯合转化子的筛选和鉴定

以筛选到的黑曲霉菌株基因组DNA为模版，用引物P3、P4进行PCR扩增，将PCR产物用HindⅢ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，1~3号重组菌株可获得与阳性对照质粒pSZHG6RpmeA相同的条带。所以1~3号重组菌株均为纯合转化子，命名为TH-2（glaA::pmeA）。

图 4 黑曲霉重组转化子的PCR酶切鉴定结果Fig.4 Identification results of PCR digestion of recombinant transformants of Aspergillus niger

2.5 重组菌株TH-2（glaA::pmeA）的发酵与检测

黑曲霉重组菌株TH-2（glaA::pmeA）发酵液上清SDS-PAGE结果如图5所示，在液体发酵培养基中添加1%的硫酸铵后，SDS-PAGE结果如图6所示。由图5可知，52 kDa的α-淀粉酶条带和60 kDa的酸稳定的α-淀粉酶条带为重组菌株的背景蛋白，但在45 kDa处增加了一条明显的蛋白条带，与预测的PmeA分子量34 kDa不符。NetNGlyc 1.0 Server分析结果表明，在PmeA中有4个潜在的N糖基化位点，推断是N糖基化修饰增大了PmeA的分子量。发酵上清液酶活检测结果如图7所示，重组菌株发酵第9 d酶活达到467.77 U/mL。

图 5 基本发酵培养基重组菌株TH-2（glaA::pmeA）SDS-PAGE检测结果Fig.5 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）in basic fermentation medium

由图5可知，加入硫酸铵的TH-2（glaA::pmeA）发酵样本α-淀粉酶条带逐渐消失。由图7可知，加入硫酸铵后酶活与对照样本相比略有提升，其发酵第8 d酶活最高，达到491.44 U/mL。

图 6 添加硫酸铵发酵培养基重组菌株TH-2（glaA::pmeA）SDS-PAGE检测结果Fig.6 SDS-PAGE detection results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）in fermentation medium with ammonium sulfate

图 7 重组菌株TH-2（glaA::pmeA）的酶活检测结果Fig.7 Enzyme activity test results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeA）

2.6 重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中pyrG基因的敲除

将含敲除原位pyrG基因载体的农杆菌AGL1（pSZH-ΔpyrG）与黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeA）进行共培养，提取转化子的基因组DNA进行PCR扩增和HindIII酶切鉴定，结果如图8所示。1~10号样本出现400 bp左右条带，与阴性对照条带相同，为未转化的出发菌株TH-2（glaA::pmeA）。11、12、13号样本与阳性对照质粒pSZH-ΔpyrG的电泳条带相同，均未出现TH-2菌株中的400 bp条带，证明为敲除pyrG基因的纯合转化子，命名为TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）。

图 8 敲除pyrG基因的重组转化子PCR鉴定结果Fig.8 PCR identification results of recombinant transformants knocked out of pyrG gene

2.7 重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）中asaA基因的敲除

使用本实验室已构建好的敲除asaA基因的农杆菌AGL1（pSZHA-pyrG）与黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeAΔpyrG）进行共培养。提取转化子的基因组DNA进行PCR扩增和HindIII酶切鉴定。结果如图9所示，1~8号重组菌株与阳性对照质粒pSZHApyrG的电泳条带相同，证明为敲除asaA基因的纯合转化子，命名为TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）。

图 9 敲除asaA基因的重组转化子PCR酶切鉴定结果（HindIII）Fig.9 Identification results of PCR digestion of recombinant transformants knocked out asaA gene（HindIII）

2.8 重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的发酵与检测

将上述重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）在添加1%硫酸铵的发酵培养基中发酵培养，并进行SDS-PAGE检测，结果如图10所示。在发酵第6 d后可以得到一条明显的果胶甲酯酶蛋白条带，重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasAA）不再分泌60 kDa的酸稳定α-淀粉酶，同时通过加入硫酸铵降解了其分泌的52 kDa的α-淀粉酶背景蛋白。

图 10 重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）SDS-PAGE检测结果Fig.10 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）SDS-PAGE test results

取1号纯合重组菌株3~8 d上清发酵液进行酶活测定，结果如图11所示，第8 d酶活最高，可达255.40 U/mL，可以表明1号纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果胶甲酯酶具有较高酶活。

图 11 重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）的酶活检测结果Fig.11 Enzyme activity test results of recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）

2.9 重组果胶甲酯酶的酶学性质测定

取纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）发酵第8 d上清液。对其在不同温度条件下的酶活进行测定，以50 ℃时的酶活为计算标准，结果如图12所示，在50 ℃时果胶甲酯酶活性到达峰值，随后逐渐回落。其中作用温度为50 ℃时的酶活为263.85 U/mL，作用温度为80 ℃时的酶活仍能达到191.24 U/mL，比在常温20 ℃条件下的酶活性还要高。可以得出结论，纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃，并具有较好的耐热性，在80 ℃高温条件下仍能维持其酶活性的70%以上。

图 12 重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）不同温度的酶活检测结果Fig.12 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）enzyme activity test results at different temperatures

取纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的第6 d发酵上清液。对其在不同pH条件下的酶活进行测定，以pH为8.5时酶活为计算标准，结果如图13所示，其中作用pH为4时的酶活最高，最高酶活为397.50 U/mL，为pH为8.5时酶活的195%。随后酶活随pH增加呈逐渐下降趋势。可以得出结论，纯合重组菌株TH-2（glaA::PmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果胶甲酯酶的最佳pH作用范围是3.0~5.0之间，最适作用pH为4.0。

图 13 重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）不同pH的酶活检测结果Fig.13 Recombinant strain TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）enzyme activity test results at different pH

3 讨论与结论

本实验成功构建果胶甲酯酶的超量表达载体，并将其转入受体菌TH-2中，获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。在发酵培养基中加入硫酸铵，可以有效消除背景蛋白中的α-淀粉酶。可能因为硫酸铵被菌体利用后，使得发酵培养基pH下降[24−26]，而菌体在发酵后期也会分泌酸性物质，最终导致发酵后期培养基pH下降幅度更大，激活了胞外的酸性蛋白酶活性，使α-淀粉酶被分解[27−28]，赵波等[29]为控制酵母高密度发酵过程中pH的变化，在发酵液中添加硫酸铵取得成效。但是在此条件下，背景蛋白中的酸稳定α-淀粉酶未被分解。进一步敲除了酸稳定α-淀粉酶基因获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA），通过发酵时加入硫酸铵，获得纯度较高的果胶甲酯酶[30−31]。但测得其最高发酵酶活为255.40 U/mL，低于同样条件下的黑曲霉工程菌TH-2（glaA::pmeA）的酶活491.44 U/mL，可能是asAA基因或pyrG基因的敲除对菌体的生长和代谢产生了不利影响，其原因还有待于进一步研究。

重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果胶甲酯酶在50 ℃条件下酶活性最高，最高酶活达263.85 U/mL；并且在80 ℃的高温条件下，仍能保持酶活性的70%以上。其最适作用的pH范围是3.0~5.0，最佳作用pH为4.0，在pH4.0时，最高酶活达397.50 U/mL。所以，纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeAΔpyrGΔasaA）分泌的果胶甲酯酶在酸性条件下酶促效率更高；此外，在pH为7.0时，其酶活性为最适作用pH时的60%左右。表明用本研究构建的工程菌生产的果胶甲酯酶具有较宽的作用温度和pH范围，具有很好的应用前景。