基于纤维骨架空间统计方法对雷特综合征患儿脑白质结构与疾病严重度和发育水平的病例对照研究

李冬蕴 李慧萍 朱国青 张 颖 鲁 萍 张凯峰 乔中伟 徐 琼 徐 秀

雷特综合征(RTT; OMIM 312750)是一种X染色体连锁显性遗传性神经发育障碍，病因复杂且机制不明，症状重且预后极差，缺乏有效治疗方法。典型RTT患儿中，95%由MECP2基因突变或缺失导致。在细胞水平研究中发现，MECP2缺陷神经元表现出树突形态发生受损和树突棘密度减低，这些结构缺陷可能与突触传递和神经网络活动改变有关[1, 2]。Mecp2基因敲除小鼠模型大脑神经元体积减少且更加密集成团，突触数目减少，突触复杂性降低，部分脑区存在自发性兴奋性和抑制性比例失衡[3, 4]。有学者提出RTT的发病机制是突触连接功能障碍导致神经回路及连接受损[5-8]。病理解剖学研究发现，RTT患者的大脑重量轻于正常对照组[9]，这种脑容量的降低并不是全脑范围内的，其中大脑左右半球的容量减低显著多于小脑。有学者指出,在RTT患者大脑中发现的脑容量减少不是因为脑萎缩所致[10]，而是因为树突状细胞分支化不良所致细胞衰减增加及神经元连接障碍[9, 11～13]。

MR研究发现，RTT患者灰质脑容量的减少呈区域性分布，多在枕叶及顶叶后部[14, 15]，大脑白质容量呈整体性的减低[16]，因既往白质研究方法多为肉眼观察及手动兴趣区测量，故缺乏较为精确的白质参数异常的脑区报道。弥散张量成像(DTI)可以通过测量组织内水分子的扩散能力及相关参数来反映白质结构及连接异常，是活体无创性研究白质纤维的主要手段[16]。单一的某项白质参数可能受髓鞘化程度、轴索密度、轴索直径及纤维素在体素水平的连贯性影响，若想更为精准地了解神经病理机制，有必要对DTI扫描图像获得脑白质纤维束的各项参数进行综合分析，包括各向异性(FA)、平均弥散量(MD)、轴向弥散率(DA)和径向弥散率(DR)[17]。本研究基于纤维骨架的空间统计学(TBSS)方法，提取重要的白质纤维束骨架进行精确配准和比较，综合RTT患儿的DTI多项参数指标(FA、MD、DA、DR)进行统计学分析，以更加准确地对差异区定位，提高组间比较的精准度，为解释其神经病理机制及临床症状提供新的理论依据，为RTT的诊断及靶向治疗提供新的线索。

1 方法

1.1 研究设计 病例对照研究。以符合典型RTT诊断且MECP2基因突变或缺失的患儿为病例组(RTT组)，以正常发育儿童为对照组(TD组)，基于TBSS分析白质参数指标与RTT严重度和发育水平的相关性。

1.2 伦理和知情同意 本研究经复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会批准，批准文号：复儿伦审[2014125号]。RTT组患儿均以书面形式被告知本研究内容，并由监护人签署知情同意书，TD组儿童由监护人签署MR检查知情同意书。

1.3 典型RTT诊断标准[18]满足以下4项主要症状，且此4项症状有一段倒退期，之后恢复或稳定，①已习得的目的性手技能部分或完全丧失，②已习得的口语能力部分或完全丧失，③步态异常(能力受损或没有能力)，④手刻板动作，例如绞手/紧握手、拍手/轻敲手、吃手、洗手样/搓手自动症；且排除：①继发于创伤(围生期或出生后)的脑损伤、神经代谢性疾病或引起神经系统异常的严重感染，②出生后6个月内出现明显的精神运动发育异常。

1.4 RTT组纳入标准 同时满足以下5项：①我院符合典型RTT诊断；②存在MECP2基因突变或缺失；③年龄 2～6岁；④行头颅MR常规扫描；⑤行Griffith精神发育量表-中文版(GDS-C)测评[19]和RTT严重程度评分(RSSS)[20]。

1.5 TD组纳入标准 同时满足以下4项：①与病例组同期在我院儿保科或神经内科因主诉头晕、头痛就诊并行头颅MR平扫且未发现局灶性和弥漫性颅内病变的女孩；②年龄 2～6岁；③告知本研究内容，取得家长同意后，在我院行中国常模标准化丹佛发育筛查(DST)量表[21]筛查结果为正常；④排除有颅脑外伤、器质性病变或神经精神疾病。

1.6MECP2基因检测 RTT组血标本处理、测序、变异分析和结果解读均参照我院分子诊断中心建立的高通量测序数据分析和临床诊断流程2.0[22]。①基因测序：PCR扩增检测MECP2基因编码区外显子，比对序列为NM_004992.3。②基因组DNA多重连接探针扩增技术(MLPA)：使用P015C试剂盒(MRC-Holland,Amsterdam,Netherlands)检测MECP2基因的拷贝数变异(基因缺失/重复)。③全基因组芯片分析(array-CGH)：应用Agilent aCGH4×180K定制芯片检测全基因组范围的基因组不平衡现象，参比序列为GRCh37/hg19。

1.7 行为评估 GDS-C、RSSS和DST测评均在我院儿童保健科完成，测评时间与MR检查相距≤1个月。需要说明的是，RSSS测评由3名儿童保健科医生完成，保证RTT组每例患儿至少有2名医生同时测评，即有2个RSSS测评结果，取其平均值。

1.7.1 GDS-C测评 对GDS-C的5个能区(ADQ：运动能区发育商，BDQ：个人-社会能区发育商，CDQ：听力-语言能区发育商，DDQ：手眼协调能区发育商，EDQ：表现能区发育商)的发育情况进行测评；发育商(DQ)=发育龄/实际年龄×100。

1.7.2 RSSS测评 对7种临床表现(抽搐发作频率及控制情况、呼吸异常、脊柱侧弯、行走能力、手的功用、语言能力、睡眠)进行严重程度评分，每种临床表现按照从轻至重的详细症状描述赋0～3分。

1.7.3 DST测评 采用中国常模标准化的“0～6岁儿童智能发育筛查测验”量表对运动、社会适应及智能3个能区进行综合评价，结果以DQ表示。

1.8 MR检查

1.8.1 设备和参数设置 统一使用我院放射科GE Discovery MR750 3.0T MR机，头颅32通道矩阵线圈，扫描序列为DTI序列(SE-EPI)。配合检查者，直接行MR扫描；不能配合检查者，检查前于我院镇静中心在医生监管下口服10%水合氯醛(50 mg·kg-1)，待其熟睡后行影像学检查。DTI SE-EPI序列扫描参数：TR 4 600 ms，TE 87.4 ms，FOV 240 mm，矩阵 128×128，像素2mm×2mm×4 mm，间距0，b值分别为0、1 000 s·mm-2，弥散敏感梯度方向为15个。

1.8.2 影像数据预处理 ①格式转换：将图像原始Dicom格式转换为nii格式，使用MRIcron软件(www.mricro.com)检查图像质量，剔除伪影、错层等缺陷的被试。②头动和涡流校正：使用FSL软件[23]中的FDT工具包对DTI图像进行头动校正和涡流校正，提取B0图，使用BET工具包去头皮、提取大脑信息(阈值=0.4)。③计算弥散张量：使用DTIFit工具包计算得到DTI图像的相关参数，包括FA、MD、DA和DR，并生成相应每个被试的参数图。

1.8.3 TBSS ①非线性配准：通过FSL软件，使用非线性配准算法将每个被试的数据配准到目标模板，后对齐至MNI标准空间，检查每个被试FA图像，保证准确配准。②提取白质骨架：将所有配准的被试FA图制作平均FA模板，计算并提取白质纤维骨架，FA阈值设定为0.2，将每个被试白质纤维配准到平均FA模板纤维骨架上，提取得到每个个体的FA纤维骨架图，并分别叠加在各自的结构像上，空间位置坐标转换至MNI标准空间解剖定位。体素值：是指具有显著性差异的团块的大小，是包含有多少个体素的大小。体素峰值坐标：是指t值最大的位点的MNI坐标系坐标值。

1.9 统计学方法 人口统计学和临床数据使用统计软件包 SPSS 20.0分析。TBSS数据分析先将FA、MD、DA、DR值的组间差异通过非参数置换检验进行分析，组间数据使用无阈限的团块增强处理(TFCE)的置换检验，之后组间再行事后t检验，年龄、DQ和脑容量作为协变量，显著性水平设置为P<0.05(FDR 校正)。白质参数异常区域在每个被试中提取相应参数，采用多元线性回归分析评价RTT白质异常脑区参数值与RSSS得分及GDS-C各能区DQ值的相关性。

2 结果

2.1 一般情况 2014年6月至2021年6月符合本文RTT组纳入标准22例，符合TD组纳入和排除标准23例，均为女童，两组年龄差异无统计学意义(表1)。RTT组RSSS 测评5.5±1.3、GDS-C总DQ为15.8±6.8，其中ADQ为30.2±10.6、BDQ为14.6±9.1、CDQ为15±7.7、DDQ为9.9±6.2、EDQ为9.2±3.9。TD组DST测评总DQ为103±7(94～118)。表1显示白质参数总体结果，FA值RTT组低于TD组，MD值和DR值RTT组高于TD组，差异均有统计学意义；DA值两组差异无统计学意义。

表1 两组年龄和总体白质参数比较

2.2 两组基于TBSS的白质参数值比较 表2和图1显示，RTT组较TD组FA值减低的纤维束主要包括：胼胝体的辐射线额部(从胼胝体前方膝部传入额叶的部分)及胼胝体压部(胼胝体后侧的部分)、双侧上纵束、左侧下纵束、内囊后肢及钩形束(额叶眶皮质和海马、杏仁体的联合纤维束)。RTT组较TD组MD值升高的纤维束主要位于胼胝体体部(胼胝体中间主体部分)。RTT组较TD组DR值升高的纤维束主要包括：胼胝体膝部(胼胝体前方部分)和压部及右侧矢状层。RTT组较TD组DA值升高的纤维束主要位于胼胝体体部和压部。需要说明的是，两组比较差异无统计学意义的纤维束无法标注具体体素和坐标。

2.3 RTT组白质参数异常区域与RSSS测评分及GDS-C能区DQ值的相关性 表3显示，RTT的RSSS得分与胼胝体辐射线额部和左侧上纵束的FA值呈负相关，与胼胝体体部MD值、DR值和DA值呈正相关。内囊后肢FA值与GDS-C总DQ、A～E能区的DQ均呈正相关。右侧矢状层DR值与GDS-C总DQ、A～E能区的DQ均呈负相关。

表2 两组基于TBSS方法比较参数值差异的白质纤维分布

图1 雷特综合征组相对于正常发育对照组

3 讨论

本研究利用MR的DTI成像结合TBSS分析技术，提取重要的白质纤维束骨架进行精确配准和比较，更加准确地进行组间比较及纤维束定位。本文发现，在RTT患儿中，胼胝体的辐射线额部和压部、双侧上纵束、左侧下纵束、内囊后肢及钩形束的FA值明显减少，胼胝体体部MD值明显升高，胼胝体膝部和压部的DR和DA值均升高。在成熟障碍和发育异常的大脑中，DTI的各项参数会产生相应的变化。FA值反映的是水分子各向异性成分占整个弥散张量的比例，间接反映白质纤维束的完整性，FA值减低提示纤维束完整性下降；MD值反映的是分子整体弥散水平，升高可能提示退行性改变导致的细胞膜密度减低；DR值升高可能提示退行性改变导致的髓鞘完整性被破坏，这种病理机制使晚髓鞘化的纤维束(如额叶纤维束、胼胝体膝部)较早受到损害；DA值异常提示轴索完整性被破坏[24]。

表3 RTT组白质参数异常区域与RSSS测评分及GDS-C能区DQ值的相关性分析

胼胝体是大脑两半球间最主要纤维连接集合体，其髓鞘化异常可能间接反映RTT患儿存在左右脑连接不良。本研究结果还显示RTT组的上下纵束、内囊后肢及钩形束均存在FA值显著性下降。上下纵束主要连接同一侧大脑半球内的额叶、枕叶和颞叶；内囊后肢包含基底节连接至额叶、颞叶、顶叶纤维束；钩形束是边缘系统主要连接额叶眶皮质和海马、杏仁体的联合纤维束[28]。这些结果可能均提示RTT儿童不但存在左右脑之间的连接不良，同时存在同一侧各脑区间连接不良，即广泛的大脑连接不良，但仍需网络连接的直接证据证实该假说。

本研究提示，RTT患儿的内囊后肢FA值及右侧矢状层DR值与GDS-C总DQ及各能区DQ均呈显著性相关。内囊后肢纤维束及矢状层纤维束主要由连接基底节和脑干等皮层下结构与大脑皮层的感知觉传导纤维组成[29, 30]。研究发现，皮层下-皮层环路主要参与了认知功能的发育，多种神经发育障碍性疾病与皮层下-皮层环路的结构及连接异常相关[31, 32]。在ASD患儿中，影像学研究发现皮层下区域(如基底节和小脑)与大脑皮层区域存在代谢产物异常、结构及功能连接异常[33, 34]。近期在Mecp2基因敲除小鼠模型中，研究者同时发现在皮层下(主要包括基底节及相关白质纤维束)和皮层部分脑区均有结构异常，且这些结构异常与小鼠的行为学及表型改变相关[35]。本研究结果与该结论较为一致，提示在RTT患儿中可能也存在多种神经发育障碍性疾病与皮层下-皮层环路的结构及连接异常，但仍需进一步行脑网络研究，以得到支持该环路功能受损的直接证据。

本研究样本量较少，未来多中心大样本的纵向研究尤为重要，对RTT患儿的临床表现、合并症、严重程度、发育情况、结构MR指标以及功能MR指标进行纵向定期评估和监控，以期对RTT的发病机制、基因型、表型、神经网络机制进一步探讨。