新型冠状病毒肺炎疫情前后急性呼吸道感染儿童支原体、衣原体和常见病毒谱分析

罗小娟 蔡德丰 任振敏 刘永秋 刘 景 黄丽兰 刘小兰 曹 科 陈运生

急性呼吸道感染(ARTI)是 5 岁以下儿童的主要死因之一。早期明确病原，有助于临床采取针对性治疗，减少抗生素不合理应用[1]。然而，ARTI病原复杂多样，不同病原所致临床表现缺乏特异性，且不同地域和气候特征条件下ARTI病原可能存在不同的流行特征，加上病毒易变异和新型病毒的出现，导致ARTI的病因诊断较为困难[2-4]。深圳市具有亚热带季风气候特点，也是中国最大的移民城市，ARTI病原学可能具有独特的流行特征。此外，新型冠状病毒肺炎(COVID-19)流行暴发以来，ARTI的病原流行特征和病原谱可能发生了重要变化。本研究旨在了解深圳市儿童常见呼吸道病原体的感染情况和流行特征，并比较 COVID-19疫情前后病原谱的变化，为本地区ARTI的临床诊治及防控提供参考。

1 方法

1.1 纳入标准 2019年9月2日至2021年2月28日深圳市儿童医院(我院)因临床诊断ARTI(诊断标准参照文献[5])住院首次采集并送检的咽拭子标本、年龄29 d至18岁的患儿。

需要说明的是，同一患儿多次因ARTI住院的，每次入院首次采集的咽拭子标本均纳入分析。

1.2 排除标准 ①根据入院临床诊断，排除先天性遗传病、免疫缺陷病、恶性肿瘤等；②排除本次住院期间接受了放化疗或免疫抑制剂治疗。

1.3 分组考虑 ①以2020年3月至2021年2月的数据进行不同季节的ARTI病原谱比较，春季为3～5月，夏季为～8月，秋季为～11月，冬季为12月至次年2月。②按患儿年龄分为29 d至6月组、～1岁组、～3岁组、～6岁组、～18岁组。③以2019年9月2日至2020年1月24日的数据作为COVID-19疫情前组、2020年9月2日至2021年1月24日的数据作为疫情后组。

1.4 咽拭子样本采集 患儿在入院当天采集咽拭子。由我院经过护理部统一培训并考核合格的护士，使用专用的植绒拭子(意大利科潘恩股份公司，国械注进20172410211)，左手用压舌板压住患儿舌头，右手将拭子伸至咽峡处，适度用力擦拭咽后壁或悬雍垂的后侧和两侧扁桃体部位并旋转拭子3圈以增加接触面，避免接触舌和口腔黏膜等处，取样后迅速将拭子放入装有3 mL细胞保存液(宁波海尔施基因科技有限公司，浙甬食药监械生产备20150063号)的采样管中，靠近采样管顶端处折断拭子并弃去尾部，旋紧管盖，2 h内送达实验室，保存于-20℃冰箱，24 h内完成检测。

1.5 病原学检测 采用核酸提取试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司，浙甬械备20150246号)和13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(宁波海尔施基因科技有限公司，浙食药监械生产许20130074号)，经全自动核酸提取仪Smart LabAssist-32磁珠法提取病原体总核酸。通过多重PCR与毛细电泳联用技术，用针对13种常见呼吸道病原体核酸序列特异区域的荧光标记引物，在1个扩增管中进行多重反转录和聚合酶链反应，扩增产物在3500 Dx自动测序仪上进行毛细电泳，经Gene Mapper(ABI Prism)分析扩增片段的大小和峰高，得到相应病原体的检测结果。严格按照仪器和试剂盒说明书进行操作。试剂盒带有RT-PCR内参，可对样本核酸提取、RT-PCR和毛细管电泳进行全程质量监控。通过对RNA和DNA中的人类管家基因进行PCR扩增，进行样品质量监控，如PCR产物经毛细电泳可见人RNA、DNA内参峰，说明采样质量合格。同时设立阳性对照(13种病原体检测靶点和人RNA、DNA的重组质粒)和阴性(人基因组溶液)对照。

13种常见呼吸道病原体检测项目包括：甲型流感病毒(IVA，含H7N9、H1N1、H3N2、H5N2)、季节性H3N2病毒、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒(IVB，含Victoria株和Yamagata株)、副流感病毒(HPIV，含1型、2型、3型和4型)、呼吸道合胞病毒(RSV，含A组和B组)、腺病毒(HADV，含B组、C组和E组)、鼻病毒(HRV)、偏肺病毒(HMPV)、冠状病毒(HCOV，含229E、OC43、NL63和HKU1)、博卡病毒(Boca)、肺炎支原体(MP)和衣原体(Ch，含沙眼衣原体和肺炎衣原体)。

同时检出≥2种病原体为混合感染。

1.6 资料截取 由1名检验技师和1名临床医师分别从我院检验信息系统(LIS)和管理信息系统(HIS)中以月为单位导出患儿姓名、性别、年龄、临床诊断、采样时间和病原体检测结果，由第3人复核2个系统导出数据的一致性，如有月份数据不一致，则重新导出并再次核对。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，病原体检出率等计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 研究期间我院共12 734例因临床诊断ARTI而送检的咽拭子样本，其中新生儿89份，先天性遗传病、免疫缺陷病、恶性肿瘤患儿271例，接受放化疗或免疫抑制剂治疗156例，ARTI患儿在住院期间非首次采样的咽拭子标本196例。最终12 022例咽拭子标本进入本文分析，男7 226例，女4 796例，年龄29 d至17岁11月龄，平均(2.8±3.0)岁。

2.2 13种ARTI病原检出情况 12 022例ARTI住院患儿病原体阳性7 589例(63.13%)，检出率由高到低依次是：HRV 24.83%(2 985例)、 RSV 14.12%(1 698例)、HPIV 8.33%(1 001例)、HMPV 7.01%(843例)、MP 5.37%(645例)、HADV 4.26%(512例)、Boca 2.94%(353例)、HCOV 2.70%(325例)、IVA 2.33%(280例)、H3N2 1.50%(180例)、Ch 0.93%(112例)、H1N1 0.47%(56例)、IVB 0.18%(22例)。

混合感染1 329例(11.05%)，其中同时检出2种病原体阳性1 238例(10.29%)、2种病原体阳性88例(0.74%)、4种病原体阳性3例(0.02%)，以HRV+MP最常见，具体见表1。

表1 1 329例混合感染的ARTI患儿咽拭子标本的病原体分布

2.3 不同季节的ARTI病原谱比较 2020年3月至2021年2月共 8 357例ARTI患儿咽拭子标本进入分析，不同季节的检出率由高到低依次为：秋季66.94%(1 924/2 874)、冬季66.44%(2 029/3 054)、夏季56.88%(918/1 614)、春季16.20%(132/815)。春、夏、秋、冬季混合感染检出率分别为0.74%(6例)、3.41%(55例)、8.18%(235例)和2.39%(73例)。IVA在春季和夏季各检出1例，IVB仅在夏季检出1例，H1N1和H3N2在全年均未检出，图1显示，其余9种病原体在不同季节的检出率差异均有统计学意义(P均<0.001)。春季检出率最高的病原体为HRV和MP，夏季和秋季均为RSV和HRV，冬季为HRV和HMPV。

2.4 不同性别、不同年龄ARTI患儿的病原谱比较 男患儿病原体检出率为63.58%(4 594/7 226)，女患儿为62.41%(2 993/4 796)，差异无统计学意义(χ2=1.69，P=0.19)。 RSV和Boca在男患儿中检出率分别为15.00%和3.31%，明显高于女患儿的12.80%和2.38%(χ2=11.49，P<0.001；χ2=8.76，P<0.001)，HMPV在女患儿中的检出率(7.86%)明显高于男患儿的6.45%(χ2=8.81，P<0.001)。

图1 不同季节ARTI病原体检出率比较

29 d至6月组、～1岁组、～3岁组、～6岁组和～18岁组病原体检出率分别为60.11% (1 269/2 111)、66.31% (1 104/1 665)、67.73% (2 485/3 669)、68.20% (2 003/2 937)、41.65% (683/1 640)， 差异有统计学意义(χ2=1 036.88，P<0.05)；混合感染检出率分别为11.32%(239例)、8.59%(143例)、12.24%(449例)、13.55%(398例)和6.16%(101例)。图2显示，随年龄增长，RSV和HPIV检出率呈明显下降趋势，MP检出率呈上升趋势。除HCOV、H1N1和IVB外，其他10种病原体在不同年龄患儿中的检出率差异均有统计学意义。

图2 不同年龄ARTI患儿的病原体检出情况

2.5 COVID-19疫情前后同时段病原谱比较 图3显示，COVID-19疫情前病原体检出率为78.57%(2 592/3 299)，由高到低依次为HRV(36.37%)、MP(15.40%)、RSV(10.03%)、HADV(9.03%)等，混合感染764例(23.16%)。疫情后同期病原体检出率为65.89%(3 500/5 312)，由高到低依次为HRV(23.78%)、RSV(14.74%)、HMPV(12.65%)、HPIV(12.12%)等，混合感染459例(8.64%)。COVID-19疫情前后同期比较，除HCOV以外，其余12种病原体的检出率差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 COVID-19疫情前后同时段病原谱比较

3 讨论

病原学诊断是ARTI诊治的关键，然而，据报道25%～60%病例难以明确病原[6]。针对ARTI常见呼吸道病原进行多重、联合和高通量检测，对早期明确病原体及合理用药具有积极意义。本研究采用多重PCR与毛细电泳联用技术，检测ARTI住院患儿咽拭子标本中13种常见的呼吸道感染病原体，结果显示，深圳地区ARTI住院患儿ARTI病原以HRV、RSV、HPIV、HMPV、MP和HADV最常见，与2015年《新英格兰医学杂志》[7]报道的儿童肺炎病原体(按检出率高低依次为：RSV、HRV、HMPV、HADV、MP、HPIV)结果相似，与国内研究[8-13]报道的ARTI病原谱存在一定差异，可能与检测时间和地域不同、检测方法和纳入检测的病原体种类不同，以及纳入研究对象存在差异(门诊或住院病例、年龄、呼吸道感染部位)有关。

本研究中深圳市儿童ARTI的病原特征如下：①总体检出率较高(63.13%)，2019年秋季检出率达80.87%，高于文献[8，11～14]中ARTI患儿病原体检出率(10.64%～60.35%) ，低于文献[9,10]下呼吸道感染住院患儿病原体检出率(分别为78.7%和80.1%)，可能与这2篇文献中检测的病原体种类较多(分别为18和22种)有关。此外，相比传统的病原分离培养方法和血清免疫学抗体检测，多重PCR技术敏感度、特异度、通量高，覆盖广，效率高，对ARTI病原诊断和混合感染的检测具有优势。②存在明显的季节和年龄分布特点，冬、春季是呼吸道感染的高发季节，但本地区ARTI病原体检出率却为秋季最高(67.01%)，春季最低(16.20%)，且2020年3月至2012年2月仅检出2例(2/8 357)IVA，未检出H1N1和H3N2，与上年度(2019年9月至2020年2月)检出IVA 278例(7.59%)、H1N1 56例(1.53%)、H3N2 180例(4.92%)比较，这些病原体检出率呈急剧下降。北京地区董静肖等[15]对门诊发热伴呼吸道症状患儿的病原分析同样显示，IVA检出率在COVID-19爆发流行后显著下降。一方面，可能与IVA的自然流行趋势和病毒变异有关。另一方面，可能与2020年初爆发COVID-19，患儿减少到医院就诊以及人群普遍采取严格的防控措施有关。本研究中夏、秋季检出率以RSV为首，HRV次之；冬季HMPV检出率最高；春季以HRV、MP检出为主，与国内其他地区报道[16,17]不同，可能与深圳市夏季高温多雨、冬季阴冷潮湿的亚热带季风气候有关。

本研究中6月至6岁患儿病原体检出率均高于总体人群。随着年龄增长，RSV和HPIV检出率明显下降，MP检出率明显升高，与国内其他研究[18,19]报道一致。虽然随着年龄增长，病毒检出率有所下降，但HRV和HMPV在>6岁儿童中检出率仍较高，应引起重视。

混合感染较多见，同时检出≥2种病原体1 329例(11.05%)，以HRV+MP、HRV+RSV、HRV+HPIV常见。HRV是小RNA病毒科肠道病毒属，在无明显呼吸道感染症状的儿童中检出率明显高于RSV和HADV，单独感染时症状轻微，不增加儿童住院风险[20]，提示其是条件致病微生物，在原发性感染导致机体免疫力下降时易继发感染。因此，混合感染是存在条件致病微生物的定植还是感染，需综合判断。有研究表明，RSV合并其他病原感染可加重病情并增加治疗难度，可能与免疫炎症反应的正反馈效应导致细胞因子和炎症介质释放增加，加重小气道黏膜充血水肿，使分泌物增加，进而导致气道狭窄和氧交换障碍有关[21]。

本研究显示COVID-19疫情后ARTI住院患儿病原体总体检出率和混合感染率较疫情前同期明显下降，提示采取佩戴口罩、减少人员聚集、做好个人防护等防疫措施，以及全民公共卫生素养提高，可有效降低ARTI疾病传播和流行。疫情前后ARTI病原谱发生明显改变，疫情前组以HRV、MP、RSV、HADV和IVA为主。疫情后组以HRV、RSV、HMPV、HPIV和Boca为主。COVID-19流行期间ARTI病原流行特征变化包括：①MP和IVA检出率显著减少；②往年秋冬季高发的RSV感染提前在7～10月出现；③新型病毒如HMPV和Boca检出率增加。相关研究表明，HMPV和Boca感染临床症状明显，可导致支气管炎、毛细支气管炎，也可引起重症肺炎，在儿童社区获得性肺炎中检出率为4.1%～11.5%[22]，提示人类感染性疾病愈发复杂，防控工作任重道远。

本研究局限性：①研究对象为ARTI住院患儿，未纳入门诊轻症患儿；②检测病原体为13种呼吸道感染常见的病毒和非典型病原体，未检测其他引起呼吸道感染的病原体，如肺炎链球菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌等细菌，真菌，寄生虫，对新发未知病原体和罕见病原体亦无法检出。