Notch3对促进胰腺星形细胞活化的基因表达及信号通路的影响*

宋海岩， 周志新， 张玉祥

(1. 新乡医学院基础医学院 新乡市分子神经病学重点实验室， 河南 新乡 453003； 2. 新乡医学院， 河南 新乡 453003； 3. 首都医科大学生物化学与分子生物学系， 北京 100069)

胰腺星形细胞即PSCs，因其与肝星形细胞(hepatic stellate cells，HSCs)具有相似的形态结构和功能而得名[1, 2]。PSCs常常作为体外的细胞模型用于与胰腺纤维化相关的疾病研究。本课题组前期的研究结果显示Notch3参与调节PSCs的活化[3]，利用Notch3 siRNA敲低活化的PSCs中Notch3的表达后，细胞的生物学特性发生改变，细胞的活化程度降低，但是抑制Notch3的表达后，PSCs中其它基因的表达会发生哪些改变，如与PSCs的活化相关的基因，Notch3是否影响参与PSCs的活化的其他信号通路尚不十分清楚。本研究通过原代培养小鼠活化的PSCs，利用siRNA转染技术，敲低活化的PSCs中Notch3的表达后，对PSCs转录组进行并行测序，检测不同条件下细胞中的基因表达情况，为进一步研究影响PSCs活化的机制，为临床诊断胰腺癌间质细胞的治疗方法的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级野生型C57BL/6J小鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重20～25 g，雌雄不限，光照时间按照昼夜更替12 h: 12 h，在室温条件下自由饮食，直至实施实验。

1.2 实验试剂

DMEM/F12培养基(HyClone公司)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco公司)，青霉素-链霉素溶液(碧云天生物技术有限公司)，α-SMA抗体(DAKO公司)，Fibronectin抗体，Collagen I抗体(Proteintech公司)，GAPDH抗体(SIGMA公司)，Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-rabbit IgG，Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG(Invitrogen公司)，Notch3 siRNA购自于Santa Cruz公司，Notch3 siRNA-1由GenePharma(吉玛)公司合成,阴性对照siRNA(negative control siRNA，NC siRNA)购自于Santa Cruz公司。

1.3 小鼠PSCs原代培养

根据文献[4]取出原代分离培养小鼠PSCs，37℃，5% CO2培养箱中培养1 h(利于组织贴壁)后加入足量的完全培养液继续培养，以后每隔1 d换液。

1.4 细胞免疫荧光染色

取培养状态较好的PSCs弃去培养液，每盘加入1 ml 0.25% 的胰蛋白酶溶液进行消化，离心后制成细胞悬液。取6孔板1个，每孔加入无菌的盖玻片1张。将吹打均匀的细胞悬液加到6孔板中，37℃，5% CO2培养2 d后，弃去培养液，PBS洗2遍。4% PFA固定10 min。5% 的驴血清室温封闭1 h。 加I抗孵育(α-SMA, 1∶100; collagen I, 1∶50; fibronectin抗体1∶50)，4℃孵育过夜。抗兔荧光Ⅱ抗594或抗小鼠荧光II抗488 1∶1 000稀释，室温避光孵育1 h。DAPI室温避光孵育5 min。抗荧光淬灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光激发情况，采集图像。每组设置6个复孔。

1.5 Notch3 siRNA，Notch3 siRNA-1及NC siRNA转染至PSCs

取生长状态良好的PSCs，按照2×105cells/ml的密度铺种细胞至6孔板中，在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h，当培养板中的细胞融合度达70-80% 时进行转染。细胞分组为空白对照组(MOCK组)，阴性对照组(转染Notch3 siRNA negative control，NC组)，Notch3 siRNA组(转染Notch3 siRNA，N3 siRNA组)及Notch3 siRNA-1组(转染Notch3 siRNA-1，N3 siRNA-1组)。以100 μl DMEM/F12培养液稀释适量的 siRNA(Santa Cruz的产品为5 μl，吉玛的产品为2.5 μl)。NC组以100 μl DMEM/F12培养液稀释5 μl NC siRNA(Santa Cruz的产品)。以100 μl DMEM/F12培养液稀释5 μl LipofectamineTM2000，混合siRNA与LipofectamineTM，将siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入6孔板中，每孔加入800 μl无血清DMEM/F12培养液，轻轻摇晃培养板，使液体均匀覆盖细胞(Notch3 siRNA与Notch3 siRNA-1的终浓度均为50 nmol/L，，阴性对照siRNA终浓度为50 nmol/L)，空白对照组只加1 ml无血清DMEM/F12培养液。37℃，5% CO2细胞培养箱中培养5 h后，各组均更换含20% FBS的DMEM/F12培养液继续培养，转染48 h的PSCs提取总RNA。每组设置6个复孔。

1.6 RNA提取及检测

取转染48 h的PSCs，利用Trizol Reagent裂解细胞，冰上裂解5 min。将各组Trizol裂解液中的细胞吸至无RNA酶的1.5 ml Ep管中，先后加入三氯甲烷，异丙醇及75% 乙醇提取RNA。最后小心弃去上清，敞开管盖于室温干燥5～10 min，以20～30 μl无RNA酶水溶解RNA，55℃ 金属浴上加热5 min以促进RNA溶解。取1 μl总RNA用NanoDrop®ND-1000分光光度计检测其浓度及纯度(OD 260/280应在1.9～2.1之间)，分装后于-80℃保存备用。

1.7 转录组测序

转染48 h的PSCs提取总RNA后，测定RNA浓度及纯度后，送至安诺优达基因科技(北京)有限公司进行转录组测序，即RNA-sequencing(RNA-seq)分析。

2 结果

2.1 免疫荧光染色检测活化的PSCs中α-SMA, Fibronectin及Collagen I 的表达

研究显示，活化的PSCs特异性的表达α-SMA，并合成分泌大量的Collagen I和Fibronectin，本研究对培养10 d活化的PSCs进行免疫荧光染色的结果显示，培养10 d的活化的PSCs中α-SMA，Fibronectin及Collagen I都有明显的表达(图1)。DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，DAPI的发散光为蓝色，显微镜下看到显蓝色荧光的为细胞核，Merged的图片为与抗体的细胞和其细胞核的合成图片，说明与抗体结合的是细胞，而非非特异性着色。这些结果表明，本研究对活化的PSCs进行的原代培养成功，可用于后续实验。

Fig. 1 The expressions of α-SMA，fibronectin and collagen I in PSCs(n=6)

2.2 总RNA样品检测结果

RNA-seq对样品的纯度及浓度均有一定的要求，样品纯度要求：260/280的OD值应在1.8至 2.2之间；电泳检测28 S∶18 S至少大于1.8。样品浓度：总RNA浓度不低于400 ng/μg。本研究中提供的样品检测报告显示，样品合格符合建库要求(表1)。

Tab. 1 The test results of sample quality

2.3 差异表达基因统计分析

构建好的文库用Illumina平台进行测序，通过对测序结果的分析得到上下调基因个数(表2)。N3 siRNA组(N3 siRNA-1)组和N3siRNA NC 组，对差异表达基因进行聚类分析，可以很直观反映出不同实验条件下样本差异表达基因的变化情况(图2)。表达量的变化用颜色的变化表示，蓝色表示表达量较低，红色表示表达量较高。通过分析发现，与NC组相比较，在N3 siRNA组与N3 siRNA-1组，α-SMA基因，collagen I基因，fibronectin基因及CTGF基因均表达下调，与胶原蛋白代谢过程相关的基因表达上调，正向调节胶原生物合成的基因表达下调，而负向调节胶原生物合成的基因表达上调，PCNA基因表达下调。

Tab. 2 Statistical results of differentially expressed genes obtained from intergroup n=6)

2.4 GO(Gene Ontology，基因本体)分析统计

GO总共有三个Ontology，分别描述基因的生物过程(Biological Process)、细胞组分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)。通过分析发现，生物过程部分中，与NC组相比较，在N3siRNA组与N3siRNA-1组，调节细胞聚集的基因表达下调；在细胞组分部分，细胞外基质的基因表达下调(表3)。

Fig. 2 Clustering figure of different genes

Tab. 3 Statistical results of differentially expressed genes obtained from intergroup comparisons

2.5 KEGG通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)是基因组破译方面的数据库，对每个比较的通路图进行注释，红色表示上调差异基因，绿色表示下调差异基因。通过对数据的筛选分析发现，与NC组相比较，Notch3 siRNA组中细胞粘附分子信号通路中，表达上调的基因有27个，而表达下调的基因有13个，表明细胞的粘附能力增强，如图31所示，Notch信号通路的活化可直接作用于MAPK信号通路，与NC组相比较，Notch3 siRNA组在MAPK信号通路中表达下调的基因有14个，而表达上调的基因有6个，表明抑制PSCs中Notch3的表达可进一步抑制MAPK信号通路。同时，与NC组相比较，Notch3 siRNA组TGF-β信号通路中表达下调的基因为7个，且无表达上调的基因，表明抑制PSCs中Notch3的表达可进一步抑制TGF-β信号通路。

3 讨论

在正常的胰腺组织中PSCs处于静息态，即非活化状态；而在各种因素作用下，静息状态的PSCs，可转化成具有肌成纤维细胞样(myofibroblast-like)特征的活化状态，活化的PSCs在形态和功能上都发生较大的变化，如细胞胞体增大，细胞突起增多，细胞形态的呈现为肌成纤维细胞样细胞特征[5, 6]，特异性的表达α-SMA，并合成分泌大量的Collagen I和Fibronectin，细胞增殖、迁移能力增强[7, 8]

活化的PSCs在胰腺纤维化及胰腺癌的发生发展过程中发挥着重要作用[9-12]，因此，针对PSCs的研究越来越受到研究者的关注，针对PSCs的胰腺癌治疗方法也可成为临床胰腺癌治疗的新的研究方向。

本研究利用原代培养小鼠正常胰腺星形细胞作为模型细胞，免疫荧光染色结果显示，培养10 d的活化的PSCs中α-SMA，Fibronectin及Collagen I均有明显的表达。这些结果表明，本研究对PSCs进行的原代培养成功，为下一步的研究奠定了基础。

本研究前期的研究结果显示[3]，利用Notch3 siRNA敲低活化的PSCs中Notch3的表达后，细胞中α-SMA，Fibronectin及Collagen I的表达显著降低，细胞迁移增殖的能力也降低，这就提示细胞的活化程度降低，细胞的生物学特性发生了改变。那么，利用siRNA敲低PSCs中的Notch3后，为分析PSCs中的其它基因表达的变化，本研究对各组PSCs进行转录组测序(RNA-sep)。

RNA-sep是高通量检测样本中所有基因表达的技术，被广泛应用于为当前生物医学研究中。普通的RNA-sep多用于细胞的混合样本的mRNA测序，对不同样本或组别之间的差异表达分析和差异表达基因的功能富集分析[13]。本研究中，首先对样品的质量进行检测，结果显示：各组样品均符合建库要求，可上机测序，对数据进行生物信息分析。通过分析发现，与NC组相比较，敲低PSCs中的Notch3表达后，α-SMA基因、collagen I基因、fibronectin基因及CTGF基因均表达下调，同时，与胶原蛋白代谢过程相关的基因表达上调，正向调节胶原生物合成的基因表达下调，而负向调节胶原生物合成的基因表达上调，这就表明胶原蛋白的合成能力下降，而且其分解代谢的能力增强，细胞合成ECM的能力下降，PCNA基因表达下调，提示PSCs细胞增殖能力降低；在GO分析的生物过程部分中，与NC组相比较，敲低PSCs中的Notch3表达后调节细胞聚集的基因表达下调，细胞外基质的基因表达下调，表明细胞的迁移聚集能力下降，ECM合成的能力下降。

据众多的研究报道，多种信号通路参与PSCs的活化及功能的调节。离子通道 TRPC3 参与PSCs迁移[14]，生长因子及酒精等可通过激活MAPKs参与调节PSCs的活性[15]，Wnt/β-Catenin信号通路[16]，TGF-β/SMAD信号通路[17-19]等均参与PSCs的活性调节。

通过KEGG信号通路分析发现，与NC组相比较，敲低PSCs中的Notch3表达，细胞粘附分子信号通路中，表达上调的基因有27个，而表达下调的基因有13个，表明细胞的粘附性增强，而迁移聚集的能力下降，MAPK信号通路中表达下调的基因为14个，而表达上调的基因为6个，表明抑制PSCs中Notch3的表达可进一步抑制MAPK信号通路；TGF-β信号通路中表达下调的基因为7个，且无表达上调的基因，表明抑制PSCs中Notch3的表达可进一步抑制TGF-β信号通路。

综上所述，敲低PSCs中Notch3的表达，可降低PSCs的活化程度，可促进ECM的分解代谢，抑制其合成；增强PSCs的粘附能力，降低其迁移聚集能力，降低其增殖能力，这与本研究前期的结果相一致，抑制PSCs中Notch信号通路可改变PSCs的生物学特性。同时抑制Notch信号通路可对MAPK，TGF-β等信号通路产生影响，其作用尚需进一步的验证。通过转录组测序检测PSCs中的上调基因及下调基因，将为临床针对间质细胞的胰腺癌的治疗提供新的靶点。