虾青素复合有氧运动对D-半乳糖诱导大鼠肾脏衰老的干预作用及其机制*

牛衍龙， 曹建民， 周绮云， 胡 戈， 郭 娴， 刘 健， 郝 敏， 张 涛， 周海涛△

(1. 赣南医学院， 江西 赣州 341000； 2. 赣州市康复医学重点实验室， 江西 赣州 341000； 3. 北京体育大学， 北京 100084； 4. 北京联合大学， 北京 100101； 5. 北京联合大学 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室， 北京 100191； 6. 常州大学， 江苏 常州 213164)

肾脏是维持机体内环境稳定的重要器官，其受衰老影响最为突出[1]。氧化应激不仅是肾脏诱发衰老的重要危险因素，也是慢性肾脏疾病发生的生理/病理基础[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)作为细胞拮抗氧化应激的调控因子，可通过调控下游多种Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶表达，缓解和改善老年大鼠肾脏氧化应激，延缓肾脏衰老[3]。研究表明，营养与运动的联合干预具有潜在协同作用，可以提高大鼠机体抗氧化酶的活性，拮抗氧化应激[4]。虾青素作为天然抗氧化剂能够显著提高野生型线虫在氧化应激条件下平均和最大生存时间[5]。同时，虾青素可以通过调控Nrf2信号通路缓解氧化应激，改善病理性肾损伤[6]。有氧运动可以通过调控自身机能、Nrf2信号通路，拮抗衰老过程中机体氧化应激损伤[7]。虾青素可以通过促进有氧运动提升机体机能和抗氧化能力，改善大鼠脑组织因氧化应激损伤引发的功能性退化，二者具有协同作用[8]，但其复合干预在肾脏衰老中的作用及其机制鲜有报道。综上，本实验探讨虾青素复合有氧运动对D-半乳糖诱发大鼠肾脏衰老的干预作用及其机制，以期为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

60只SPF级雄性SD大鼠(3月龄，380～410 g)，购自北京斯贝福生物技术有限公司(生产合格证编号SCXK(京)2019-0010)。北京体育大学SPF级动物实验室饲养，温度20～24℃，相对湿度55%～75%，正常昼夜节律。4 d适应性饲养后，采用两因素两水平2×2析因设计将大鼠随机分为空白对照组(C组)、急性衰老组(S组)、虾青素+急性衰老组(AS组)、有氧运动+急性衰老组(ES组)、虾青素+有氧运动+急性衰老组(AES组)，每组12只。

1.2 急性衰老动物模型建立

S、AS、ES、AES组腹腔注射100 mg/(kg·d) D-半乳糖，为期6周，建立经典急性肾衰老动物模型[9]，C组腹腔注射等体积生理盐水。

1.3 运动及营养干预

6周急性衰老动物模型建立期间，ES、AES组进行强度为60%最大摄氧量的有氧运动(15 m/min速度，坡度0°，60 min/d)，其他组无运动干预。

虾青素(纯度2%，北京绿色金可生物技术股份有限公司馈赠)以蒸馏水稀释，4℃存放备用。根据文献[10]及预实验结果，AS、AES组大鼠虾青素剂量为1 g/(kg·d)(纯品剂量20 mg/(kg·d))，灌胃体积为5 ml/kg；其他组灌胃等体积蒸馏水。训练期间，每天采用专业灌胃器灌胃1次。

1.4 实验动物取材

末次训练结束后12 h，戊巴比妥钠麻醉大鼠后从腹主动脉取血，室温自然凝固，待血清出现后4℃离心10 min，3 000 r/min，分离血清，-20℃冻存待测。迅速取出双肾，称重后剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污；左侧肾脏取约1 mm×1 mm×1 mm肾皮质，迅速放置于2.5%戊二醛固定液，常温固定4 h后4℃保存；剩余左侧肾脏浸入4%多聚甲醛，固定24 h后包埋；右侧组织切块锡纸包裹投入液氮，取材结束后移至-80℃冰箱保存待测。

1.5 检测仪器

HT7700透射电子显微镜(日本日立公司)，Leica UC7超薄切片机(德国Leica公司)，BX51F32H01光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，全自动数字切片扫描系统(匈牙利3D HISTECH公司)，Allegra 25R台式高速离心机(美国Beckman Coulter公司)，Wellscan MK3酶标仪(美国雷博公司)，RF-6000荧光分光光度仪(日本岛津公司)。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 肾脏病理变化评价 取出多聚甲醛固定液中的肾脏组织，经流水冲洗和梯度乙醇(70%、80%、90%、95%、100% I、100% II)脱水，二甲苯透明后石蜡渗透，包埋，横断面切片(厚度为4 μm)烘干，进行HE染色，分别在100倍和400倍光镜下，观察肾脏组织病理变化。

1.6.2 肾脏超微结构变化评价 取出戊二醛固定液中肾脏组织，1×PBS洗3次，蒸馏水洗3次，用1%锇酸固定1 h后蒸馏水洗3次，2%铀染1 h，蒸馏水洗后(铝箔中脱水)分别浸入梯度丙酮(30%、50%、70%、90%、100%)，渗透过程为树脂：丙酮1∶3混合液1 h，树脂：丙酮1∶1混合液2 h，树脂：丙酮2∶1混合液过夜，经过3次树脂渗透后过夜，次日60℃烘箱高温聚合，精修组织块，切片机制成1 μm切片后用6 000倍透射电镜观察肾小球超微结构。

1.6.3 肾脏相关蛋白质表达检测 采用免疫组化法检测Nrf-2、磷酸化核因子E2相关因子2(phosphory lated nuclear factor erythroid 2-related factor 2, p-Nrf2)和血红素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)表达情况。石蜡切片脱蜡至水经抗原修复后，加入3%双氧水溶液室温避光孵育25 min后脱色洗涤3次进行血清封闭，随后加入一抗、二抗，进行二氨基联苯胺显色，Harris苏木素复染细胞核后脱水封片。抗体分别由Abcam公司和武汉赛维尔生物科技有限公司提供。

1.6.4 H-score评分方法 H-score评分是准确定量处理免疫组化结果的一种组织学评分方法，即采用病理切片扫描仪将每张切片进行全视野数字扫描，将阳性细胞数量及其染色强度转化为相应数值，应用公式计算H-score[11]。根据细胞核颜色，将每个组织点的染色强度转化为像素面积并计算阳性百分比，深棕色、棕黄色、浅黄色和蓝色依次判定为强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性。H-score=(弱阳性细胞密度×1)+(中阳性细胞密度×2)+(强阳性细胞密度×3)，计算后进行组间评定。

1.6.5 其他指标测试方法 采用酶联免疫吸附法测定肾脏组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和γ-谷氨酸半胱氨酸合酶(γ glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，荧光比色法测定脂褐质(lipofuscin，LPF)含量。以上试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 五组大鼠肾脏组织形态的比较

100倍及400倍光镜下观察显示(图1、图2)，C组大鼠肾小球分布密集，结构完整清晰，多呈圆形或椭圆形，肾小囊囊腔及肾小管管腔大多规整且狭小。与C组比较，S组肾小球数量明显减少，分布稀疏，球体缩小且外周不规则；肾小囊囊腔及肾小管管腔扩张明显。与S组比较，AS组肾小球明显增多，且分布较为密集，形态趋于正常，肾小管形态基本正常，但仍存在肾小囊囊腔增大现象；ES组大鼠肾小球明显增多，且分布较为密集，形态趋于正常，肾小囊形态基本正常，但肾小管管腔扩张未得到完全改善。与AS、ES组比较，AES组肾脏组织形态趋于正常，仅个别肾小管管腔存在扩张现象。

Fig. 1 Pathological changes in renal tissues of rats in each group (HE ×100)

Fig. 2 Pathological changes in renal tissues of rats in each group (HE ×400)

2.2 五组大鼠肾脏组织的比较

6 000倍电镜观察显示(图3)，C组大鼠滤过屏障视野下结构完整，基底膜厚度均匀，足细胞内细胞器丰富，线粒体大多数无明显或轻微扩张，足突未见明显融合，裂孔隔膜均匀，未见明显增宽或变窄。与C组比较，S组基底膜厚度不均，存在局部明显增厚，足突较稀疏，足细胞细胞器较少，细胞核不规则，线粒体轻度肿胀，部分膜破损，嵴减少、断裂，个别局部空泡化，足突融合，裂孔隔膜不匀，部分增宽或变。与S组比较，AS组损伤程度较低，基底膜厚度较均匀，未见明显局部增厚区，足细胞内线粒体轻度或中度肿胀，中度肿胀者局部空泡化、嵴消失，足突未见明显融合，裂孔隔膜整体较均匀；ES组结果基本同于AS组，损伤程度较低。与AS、ES组比较，AES组滤过屏障结构较完整，损伤程度低，基底膜厚度较均匀，足细胞未见明显水肿，线粒体大部分无明显肿胀，嵴少量断裂，个别局部空泡化，足突未见明显融合，裂孔隔膜整体较均匀、略窄。

Fig. 3 Renal ultrastructure of rats(TEM ×6 000)

2.3 五组大鼠肾脏组织衰老指征标志物水平的比较

肾脏组织SOD活性，与C组比较，S组显著降低(P<0.05)；与S组比较，AS组、ES组、AES组均显著升高(P<0.01)；与AS组、ES组比较，AES组均显著升高(P<0.01)。γ-GCS活性，与C组比较，S组显著降低(P<0.01)；与S组比较，AS组无显著性差异(P>0.05)，ES组、AES组均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与AS组比较，AES组显著升高(P< 0.05)，而ES组、AES组组间无显著性差异(P> 0.05)。MDA含量，与C组比较，S组显著升高(P< 0.05)；与S组比较，AS组、ES组、AES组均显著降低(P<0.01)；与AS、ES组比较，AES组均无显著性差异(P>0.05)。LPF含量，与C组比较，S组显著升高(P<0.01)；与S组比较，AS组、ES组、AES组均显著降低(P<0.01)；与AS组、ES组比较，AES组均显著升高(P<0.01，表1)。肾脏SOD活性和LPF含量两因素具有协同作用，而γ-GCS活性和MDA含量两因素协同作用不明显。

2.4 五组大鼠肾脏组织Nrf-2通路相关蛋白表达的比较

肾脏组织Nrf2蛋白质表达水平：与C组比较，S组显著降低(P<0.01)；与S组相比，AS组、ES组、AES组均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与AS组、ES组比较，AES组均显著升高(P<0.05或P< 0.01)。p-Nrf2蛋白质表达水平，与C组比较，S组显著降低(P<0.01)；与S组比较，AS组、ES组、AES组均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与AS组、ES组比较，AES组均显著升高(P<0.01)。HO-1蛋白质表达水平：与C组比较，S组显著降低(P<0.01)；与S组比较，AS组、ES组、AES组均显著升高(P<0.01)；与AS组相比，AES组无显著差异(P> 0.05)，而与ES组比较，AES组显著升高(P<0.05，表2，图4)。肾脏Nrf2和p-Nrf2蛋白质表达水平，两因素具有协同作用，而对于HO-1蛋白质表达水平，两因素协同作用不明显。

Tab. 1 SOD/γ-GCS activities and MDA/LPF concentrations in renal tissues of rats in each group n=12)

Tab. 2 H-scores of Nrf2/p-Nrf2 and HO-1 in renal tissues of rats in each group n=12)

Fig. 4 The expressions of Nrf2 and HO-1 in renal tissues in each group

3 讨论

D-半乳糖过量摄入后在体内被还原成半乳糖醇，或导致组织细胞渗透应激和线粒体功能障碍，或被氧化成H2O2降低SOD水平，或与胺形成希夫碱化合物和糖基化终产物增加机体氧化酶含量。D-半乳糖致亚急性大鼠衰老模型无论从脏器组织形态学、氧化应激相关因素等变化均与自然衰老相似，已成为公认的经典衰老模型[12]。

肾脏对氧化应激高度敏感，在人体衰老过程中，肾脏功能减退，是最快的损伤器官之一[13]。LDF是衰老重要表征，与氧化应激相关指标MDA、谷胱甘肽(glutathiose，GSH)、SOD同样是公认的衰老标志物[14]，γ-GCS作为GSH合成的催化酶和限速酶，其活性降低与GSH水平下降密切相关[15]。机体内Nrf2信号通路可以通过调控体内抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶，清除过量的自由基，拮抗氧化应激[16]。

虾青素是海洋生物中含量最为丰富的类胡萝卜素，具有强抗氧化活性。研究表明，虾青素可通过磷酸化修饰Nrf2蛋白上第40位丝氨酸，致其与Keap1解离，使抗氧化元件ARE及其保护性蛋白的合成过程被激活，改善组织器官氧化应激损伤[17]；虾青素分子结构末端的不饱和醛基和羟基为活性氧和自由基提供电子，有效清除机体内过量的自由基[18]。运动作为一种可行的、非药物疗法可逆转衰老进程中组织线粒体功能受损[19]，并通过激活生物体自身调节机能，提高机体抗氧化能力，缓解衰老所致氧化应激和炎症反应，减轻组织器官功能退化[20]。据李丹等[21]报道，有氧运动能够激活糖尿病大鼠心肌组织Nrf2信号通路，增加下游抗氧化酶表达，抵抗心肌氧化应激损伤。相关研究已证实运动与Nrf2激动剂联合具有正向协同作用，可以有效增强机体组织器官的抗氧化能力[4]。Yook等[8]研究发现，虾青素复合有氧运动干预可以协同改善动物体机能和抗氧化能力，虾青素促进有氧运动改善异常组织结构与机能。本研究中，与C组比较，S组大鼠肾脏衰老标志物：SOD、γ-GCS活性显著降低，LPF、MDA含量显著升高的同时，肾组织形态和超微结构均发生显著变化，与自然衰老大鼠各项指标变化趋势相一致[11]。与S组比较，AS组、ES组、AES组肾脏Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白质表达及SOD活性显著升高，LPF、MDA含量显著降低的同时，肾组织形态和超微结构均有所改善，提示虾青素、有氧运动均可通过调控Nrf2信号通路相关蛋白质表达缓解和改善氧化应激，延缓肾脏衰老。与AS与ES组比较，AES组大鼠改善更为明显，且部分指标存在正向协同作用，提示虾青素和有氧运动复合干预效果较单一干预更为有效。综上，虾青素、有氧运动均可激活衰老大鼠肾脏内Nrf2信号通路，上调下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达，增强拮抗氧化应激能力；而两者复合干预效果更佳，其机制可能为虾青素可以促进有氧运动修复衰老所致肾脏线粒体功能障碍，进一步提升抗氧化能力，延缓衰老。本研究结果表明，运动复合营养干预可有效地延缓肾脏衰老的发生与发展，为虾青素的深度开发与利用提供理论依据。