阀切换在线净化技术检测鱼肉罐头中苯并(a)芘

李亚，梁剑锋*，梁美艳，卓梅芳，钟水桥

1. 梧州学院化学工程与资源再利用学院（梧州 543002）；2. 梧州市食品药品检验所（梧州 543002）

苯并芘是一种含苯环的稠环芳烃，按照苯环稠合位置可分为2种：苯并[a]（1, 2-苯并芘）芘和苯并[a]芘（4, 5-苯并芘）。其中，在食品中常见的苯并芘为苯并[a]芘，其可引起人体局部组织的癌变，也可引起大鼠外周血淋巴细胞DNA、肺细胞和肝细胞损伤，因此有强烈的致癌作用，被国际卫生组织列为Ⅰ类致癌物质[1-3]。苯并芘容易在水体、土壤和农作物中残留，而水产品中苯并芘的来源主要包括原料污染和加工过程污染，如养殖水污染造成在生物体内富集，烧烤、烟熏、烘烤时受高温影响发生裂解与热聚合等反应形成[3-6]。

鱼罐头是以新鲜或冷冻的鱼为原料，经加工处理、装罐、加入调味料、密封、杀菌等加工过程制成的即食罐头产品，按照加工工艺可以分为红烧、茄汁、煎炸、清蒸、烟熏、油浸、水浸等类别[7]。由于鱼肉中含有丰富蛋白质和在加工过程使用大量油脂，而且加工过程为达到鱼肉罐头有特殊色、香、味，往往采用煎炸、红烧、杀菌等高温加工工艺，容易发生裂解和聚合反应生产有害物质苯并芘。近年来随着中国社会与经济的快速发展，食品安全公共卫生问题也随之频发，特别在2010年国内出现茶籽油中苯并芘超标食品安全事件后，公众对苯并(a)芘在食品中残留越发关注[8-11]。因此，研究鱼肉罐头中苯并(a)芘方便、快捷的检测方法，对保障公众食品安全具有重要意义。

苯并(a)芘常用检测方法有荧光分光光度法、薄层色谱法、免疫学法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱仪-质谱联用法等[12-16]。这些常用的检测方法在前处理过程中需要采用高毒害性有机试剂二氯甲烷作为溶剂萃取，同时需要成本较高的苯并(a)芘分子印迹柱净化提取液，还需要氮吹仪浓缩等手工操作步骤[17]，整个检验过程费时、费力，检验效率不高。近年来随着阀切换在线净化-超高速液相色谱仪联用技术的快速发展，其越来越多地被应用在复杂的食品安全检测领域，该技术能够实现在线净化与检测分析在系统内自动完成，具有前处理简单、灵敏度及回收率高的优点[18-21]。试验采用阀切换在线净化系统应用于鱼肉罐头中苯并(a)芘的检测，简化检测过程中样品前处理步骤，提高检测自动化程度，减少有害有机试剂的使用，保护实验人员的身体健康。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉罐头（市售）；正己烷、二氯甲烷、乙腈、异丙醇（色谱级，德国CNW公司）；SPE印迹柱（规格500 mg/6 mL，北京迪科马科技有限公司）；苯并(a)芘标准溶液（质量浓度20 μg/mL，农业部环境保护科研监测所）。

1.2 仪器与设备

1290液相色谱仪[含2个高压泵、1个六通阀、荧光检测器，安捷伦科技（中国）有限公司]；色谱柱Kromasil反C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，瑞典阿克苏诺贝尔公司）；色谱柱ChromSpher Pi（80 mm×3.0 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；ST 16R冷冻离心机（美国热电公司）；MP-48正压固相萃取（睿科集团股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线绘制

用正己烷-异丙醇（体积比1∶1）混合溶液将苯并(a)芘标准溶液（质量浓度20 μg/mL）稀释至50 ng/mL苯并(a)芘标准溶液中间液，用正己烷-异丙醇混合溶液逐级稀释质量浓度为1.0，2.5，5.0，7.50和10.0 ng/mL的标准工作液，现配现用。

1.3.2 样品前处理方法

称取2.50 g经粉碎混匀样品置于15 mL离心管中，加入正己烷-异丙醇混合溶液至5.00 mL，摇匀，用涡旋器混合3.0 min，将离心管放入冷冻离心机离心4.0 min（4 ℃、4 000 r/min），取出离心管放置至室温后吸取溶液的上清液，用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，初滤液弃去，滤液放置在液相进样小瓶待测。

1.3.3 系统分析过程

样品提取滤液经自动进样器进样，进样后系统切换阀处于图1（A）所示状态，样品进入系统第1根色谱柱分析，通过该色谱柱可以将样品中大部分非极性、小极性杂质分离出来，经阀门3直接进入废液池去除，同时目标物可以富集在该色谱柱上。系统工作过程如图1（A）所示。

系统分析一段时间样品后，通过控制六通阀进行系统中管路切换（如图1B所示），同时将系统色谱的流动相比例改变，将第1根色谱流出的富集的目标分析物洗脱出来，目标分析物进入第2根色谱柱分析后进入荧光检测器定量分析完成检测后系统中六通阀切回到图1A所示状态，流动相改变回初始比例，系统平衡5 min后进行下次测定。

图1 阀切换系统工作示意图

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化结果

在实际样品检测过程中，通过考察不同色谱柱、流动相条件、柱温箱温度进行试验，最终确定采用Kromasil反C18色谱柱作为样品中杂质去除、富集目标分析物的色谱柱，流动相采用乙腈-水（体积比82∶18），流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量500 μL（500 μL定量环）。使用ChromSpher Pi色谱柱对洗脱出的目标分析物进一步分离，流动相采用异丙醇-乙腈（体积比65∶35），流速1.2 mL/min，柱温40 ℃，FLD（荧光）检测器，发射波长406 nm，激发波长384 nm。目标分析物苯并(a)芘色谱图见图2，检测的苯并(a)芘阳性样品色谱图见图3。

图2 苯并(a)芘标准色谱图

图3 阳性样品色谱图

2.2 系统中六通阀切换时间考察

为确定合适系统六通阀切换时间，需要确定样品、目标分析物苯并芘在第1根色谱柱Kromasil反C18的各自的大致出峰时间（见图4）。由图4可知，样品中非极性、小极性杂质基本上在3.2 min前被洗脱出色谱柱进入废液池，而样品中目标分析物在3.5 min后被洗脱出色谱，因此将系统中六通阀切换时间确定在3.5 min。如果过早切换系统六通阀会，样品中过多的杂质带入第2根色谱分离柱，增加第2根色谱柱分离难度，从而影响整个系统的分离效果，可能造成检测结果偏高；在3.5 min后切换六通阀会导致部分目标分析物被洗脱到废液池，导致方法回收率降低、检测结果偏低。

2.3 方法学考察

使用贮备标准溶液配制标准曲线质量浓度为1.0，2.5，5.0，7.50和10.0 ng/mL的标准工作液，按照色谱条件进样检测，以标准溶液质量浓度为横坐标（X），标准物质荧光峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到标准曲线线性回归方程及线性相关系数和范围。试验方法的苯并(a)芘在1.0~10.0 ng/mL范围内样品浓度与响应值之间呈线性关系，其线性回归方程为Y=0.478 8X+0.012 0，相关系数r2为0.999 1，具有良好线性关系。对质量浓度1.0 ng/mL的标准溶液重复进样8次得到方法重现性及3倍信噪比计算方法检出限，方法相对标准偏差（n=8）为3.35%，检出限为0.08 μg/kg（色谱图见图5）。

图5 试验方法的检出限色谱图

2.4 样品的测定

从市场上购买5批次鱼肉罐头（分别编号T1~T5），分别采用双柱在线净化检测系统和GB 5009.27—2016进行测定，每份样品重复测定6次，两种方法检测结果分别见表1。

表1 实际样品检测结果（n=6）

试验考察阀切换超速液相色谱仪系统与G B 5009.27—2016在检测结果、标准偏差、变异系数等方面差异。从5份实际样品检测结果可知，试验方法在分析结果、标准偏差、变异系数与国标方法相近。

2.5 方法回收率与精密度

对市场上购买的常见5批次鱼肉罐头中添加苯并(a)芘标准溶液，分别进行1，5和10 μg/kg的3个水平添加，每个添加水平做6次测定，分别采用阀切换在线净化系统与国标方法测定法计算回收率和精密度，试验结果见表2和表3。

表2 试验方法的回收率、精密度测定结果（n=6）

表3 国标方法的回收率、精密度测定结果（n=6）

从测定结果可以看出，阀切换超高速液相色谱系统方法回收率在81.62%~94.85%之间，相对标准偏差（SRSD）为2.11%~4.22%，与国标方法在加标回收率、相对标准偏差方面结果接近，表明该系统试验结果符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中回收率和精密度的要求，方法检出限满足含量在μg/kg级别的检测要求[22]，表明试验方法适用于鱼肉罐头中苯并(a)芘的检测。

3 结论

试验方法通过六通阀的切换，使检测样品只需通过简单提取后，便可在系统中实现自动在线净化、富集、检测等检测过程，适用于鱼肉罐头等富含蛋白、脂肪的复杂食品中苯并芘的定量分析，该系统无需采用价格昂贵、操作复杂的苯并芘分析专用的SPE印迹柱，从而降低检测成本、提高检测效率，同时整个检测过程中无需用到二氯甲烷等剧毒有机试剂，保护试验检测人员的健康及操作环境，试验方法在检出限、加标回收率、精密度方面与国标检测方法相一致，可应用于高脂肪、高蛋白复杂食品基体中苯并(a)芘的快速检测分析。