碱提酸沉法提取汉麻籽蛋白粉的优化

石杰，宋淑敏，魏连会，杨庆丽，董艳，姬妍茹

黑龙江省科学院大庆分院（大庆 163319）

汉麻（Cannabis SativaL.）是我国麻类产业研发的主导作物，也是近年来我国麻类产业进程中发展最快的产业。汉麻种子的开发利用不仅对汉麻产业发展有着重要作用，同时也为人们提供一种具有丰富营养和保健价值的食物资源，关于汉麻籽保健食品的研究与开发成为产业热点之一。有研究表明汉麻籽是一种十分优异的蛋白来源，不含大豆寡聚糖和致敏因子，并且可以促进人体产生胶原蛋白，不会造成胃胀、反胃和过敏反应[1]。汉麻籽蛋白的分离方法主要有减提酸沉、水酶法、反胶束和膜分离法以及高压均质法。其中，水酶法的成本较高，部分蛋白质在提取过程中会被改性[2]，反胶束和膜分离法是一种较新的分离方法，生产的蛋白粉虽然纯度较高，但设备较贵，产率较低，操作复杂[3-4]，而高压均质法不但提取率低且杂质率高[5]。因此，可用于批量生产汉麻蛋白的主要是碱提酸沉法，但仍需要探索和优化提取条件以提高汉麻蛋白产率。通过单因素试验和正交试验确定和优化脱脂汉麻粕提取汉麻籽蛋白的方法，以获得高纯度的汉麻籽蛋白粉。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂汉麻粕（锦州俏牌生物技术有限公司）。

石油醚、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、磷酸、硫酸、乙醇、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯试剂）；去离子水。

1.2 仪器与设备

HH-1数显恒温水浴锅（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；GL10M大型离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；CT15RT台式高速冷冻离心机（上海天美科学仪器有限公司）；VFD-6000真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；MS300加热式恒温电动磁力搅拌器（上海般特）；UV759S紫外-可见光分光光度计（上海精科）。

1.3 试验方法

1.3.1 汉麻分离蛋白的制备工艺（单因素试验）

1.3.1.1 工艺路线

汉麻脱脂粉→石油醚再次脱脂→碱液提取→离心→上清液酸沉→离心→沉淀水洗→冻干→汉麻分离蛋白粉

1.3.1.2 操作要点

脱脂汉麻籽粕经粉碎、过筛后获得汉麻脱脂粉，与去离子水按1∶20（g/mL）料液比进行混合，用1.0 mol/L的NaOH调节料液至所需pH，放置于磁力搅拌器上，设定提取时间，在一定温度下进行碱提。碱提结束后，在4 000 r/min转速下离心20 min，保留上清液。测定上清液中蛋白质质量，比较不同碱提工艺条件下的蛋白提取率。对得到的汉麻籽蛋白上清液，用1.0 mol/L的HCl调节至所需pH，在4 000 r/min转速下离心15 min，弃去上清液（同时测定上清液存留的蛋白质浓度，以计算沉淀率），将沉淀的蛋白融入去离子水中，调节pH 6.0~7.0，得到汉麻籽蛋白凝乳，真空冷冻干燥机进行干燥。获得汉麻籽蛋白粉。

1.3.2 制备汉麻分离蛋白的工艺优化

在前期汉麻籽蛋白碱提单因素试验的基础上，采用正交试验对碱提pH、提取温度、提取时间、酸沉pH这4个影响因子进行优化，比较不同工艺条件下的蛋白提取率和沉淀率，按式（1）和（2）计算。

蛋白提取率=碱提上清液中蛋白质质量/原料中蛋白质质量×100% （1）

蛋白沉淀率=100-酸沉上清液中蛋白质质量/碱提上清液中蛋白质质量×100% （2）

表1 汉麻籽蛋白提取条件正交设计因素水平表

1.4 蛋白质浓度测定方法

采用Bradford法。

1.5 蛋白质粉含量测定方法

采用凯氏定氮法。

2 结果与分析

2.1 汉麻分离蛋白提取单因素试验

2.1.1 碱提pH对汉麻分离蛋白沉淀率及提取率的影响溶液pH改变会直接影响两性分子蛋白质的表面带点情况，从而影响蛋白质-蛋白质、蛋白质-溶剂间的相互作用，而使蛋白质的溶解性发生改变。

图1 显示，随着pH升高，汉麻分离蛋白的提取率逐渐升高，但pH＞10.5时升高的速率减慢，变化不明显，趋于平缓。强碱条件不仅会增加碱液用量，还可能会导致蛋白质中赖氨酸与丙氨酸或胱氨酸发生缩合反应，影响蛋白品质。结合随着提取pH升高，蛋白沉淀率在酸性体系中略有下降，因此碱提pH选取10.5左右。

图1 不同碱提pH下汉麻分离蛋白沉淀率与提取率的变化

2.1.2 酸沉pH对汉麻分离蛋白沉淀率及提取率的影响

酸沉即向浸提液中加入稀盐酸，将其pH达蛋白质的等电点附近，使浸提液中的蛋白质沉淀析出，与糖类、酚类等可溶性成分分离。汉麻蛋白在不同pH下的沉淀率和提取率见图2。

由图2可见，在酸沉pH 3.5~5范围内，蛋白沉淀率和提取率变化非常接近，这是由于碱液提取导致多种蛋白质组分同时溶出，而不同蛋白质有不同的等电点所致。考虑到过酸不但增加成本，还可能会导致蛋白质变性，所以选取较温和的pH 5.0为酸沉pH。

图2 不同酸沉pH下汉麻分离蛋白沉淀率与提取率的变化

2.1.3 提取时间对汉麻分离蛋白沉淀率及提取率的影响

由图3可知，提取时间对汉麻分离蛋白的沉淀率和提取率影响甚小，在50~90 min沉淀率和提取率均只相应变化约8%。这主要是缘于汉麻蛋白质的组成特点，清球蛋白溶解性较好。综合考虑生产成本和工艺周期，选定提取率最高的70 min作为最适提取时间。

图3 不同提取时间下汉麻分离蛋白沉淀率与提取率的变化

2.1.4 提取温度对汉麻分离蛋白沉淀率及提取率的影响

蛋白质在不同温度下有不同的溶解度，为提高蛋白质提取率，有必要测定温度对提取率的影响。由图4可知，随着温度提高，提取率逐渐上升，沉淀率变化不大。但过高的温度会导致汉麻蛋白的变性。因此，选择60 ℃作为最佳提取温度。

图4 不同提取温度下汉麻分离蛋白沉淀率与提取率的变化

2.2 正交试验优化汉麻分离蛋白的最佳提取工艺

料液比1∶20（g/mL），不同碱提pH、提取温度、提取时间条件下按4 000 r/min离心20 min，测定上清液中蛋白质浓度，不同pH条件下酸沉，测定上清液中蛋白质浓度。

从表2的正交试验结果可以看出沉淀率和提取率的提取条件影响大小都是A＞C＞B＞D，即碱提pH＞提取温度＞酸沉pH＞提取时间，为提高汉麻蛋白沉淀率，可选取的最佳提取工艺为碱提pH 10，酸沉pH 5，提取温度60 ℃，提取时间70 min。汉麻分离蛋白提取率的最佳工艺条件为pH 10.5，酸沉pH 4.5，提取温度60 ℃，提取时间70 min。沉淀率达到64.29%，提取率为63.54%。

表2 汉麻分离蛋白提取条件正交设计试验结果

2.3 提取工艺优化过程中汉麻分离蛋白含量监测

通过采用优化的提取工艺制备汉麻分离蛋白，课题组使用凯氏定氮法分别测定脱脂汉麻籽粕、碱提冻干后提取的蛋白粉、酸沉冻干后提取的蛋白粉及沉渣冻干后蛋白粉的蛋白质含量，结果见表3。

由表3可知，碱提酸沉法可以提取出多数汉麻分离蛋白，但仍有很多蛋白存留于残渣中。同时有非蛋白物质溶解于碱提溶液中，并仅有部分在酸沉时与汉麻蛋白同时沉淀下来。

表3 汉麻分离蛋白含量过程监测数据

3 结论与讨论

影响碱提酸沉沉淀率和提取率的条件中，碱提pH＞提取温度＞酸沉pH＞提取时间，汉麻分离蛋白提取率的最佳工艺条件为pH 10.5，酸沉pH 4.5，提取温度60 ℃，提取时间70 min。沉淀率达到64.29%，提取率为63.54%。碱提酸沉可以获得纯度90%以上的蛋白质粉，虽然仍有部分蛋白损失的现象，但已是工业化提纯蛋白质的最佳方式，试验为探索更好的汉麻蛋白质批量提纯方法提供数据支撑。