基于网络药理学及分子对接虚拟筛选疏风解毒胶囊治疗新冠病毒肺炎(COVID-19)活性成分研究

谢平，王晨情，叶雅惠，沈金海，郝春莉

(1.厦门华厦学院环境与公共健康学院，福建 厦门 361024；2.生化制药福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361024；3.厦门市食品药品安全重点实验室，福建 厦门 361024)

2019年12月以来，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的急性肺炎，在全球范围内蔓延，主要通过接触、呼吸道飞沫传播[1]。其最常见的症状是发热及呼吸道症状，轻度症状为发热、肌肉酸痛、全身乏力，呼吸道症状包括干咳，部分患者可能会伴有鼻塞、流涕及咽痛等，较严重者出现胸闷，气促，呼吸衰竭休克等严重并发症，甚至导致死亡[2]。

各省市在防治新冠肺炎过程中多以疏风解表为原则，以达到宣散表邪，改善发热等目的；对《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》[3]中的中医治疗推荐处方进行分析，医学观察期推荐使用疏风解毒胶囊(SJC)，并贯穿该病治疗全过程，表明其具有较好的预防治疗的作用。

SJC来源于民间验方，是由虎杖、连翘、甘草、马鞭草、板蓝根、败酱草、柴胡、芦根8味中药组成的复方制剂，与连花清瘟胶囊类似，具有清热解毒、疏肝解郁等功效，临床上常用于治疗急性上呼吸道感染等症状。肖琦等[4]研究发现SJC联合阿比多尔治疗时，症状消失时间及转阴时间较单用阿比多尔显著缩短。

网络药理学是基于系统生物学，对“成分-靶点-通路-疾病”网络进行分析，从整体层面分析中药复方的药效物质基础和分子作用机制；分子对接法是一种预测配体-受体的结合模式和亲合力的一种虚拟筛选方法。研究表明[5-6]，SARS-CoV-2是通过其表达的S蛋白识别人类宿主的ACE2蛋白从而进入细胞，相当于病毒感染人体的钥匙，SARS-CoV-2 3CL水解酶则为病毒在细胞内的转录和复制过程中的重要水解酶，三者被认为是有效的治疗靶点。本研究拟通过网络药理学及分子对接虚拟筛选SJC治疗COVID-19的潜在活性成分，为SJC的深入研究及COVID-19的诊疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 SJC活性化合物及靶点筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/)，中医药综合数据库(TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/)搜索SJC全方中“虎杖”“连翘”“甘草”“马鞭草”“板蓝根”“败酱草”“柴胡”“芦根”对应化合物成分及靶点。同时作为口服药物，药物的类药性(drug likeness，DL)及口服利用度(oral availability，OB)等参数尤其重要[7]，筛选(OB≥30%且DL≥0.18)构建潜在活性成分数据集，相关靶点通过Uniprot(https://www.uniprot.org/)，转换对应基因名。

1.2 构建“药材-活性成分-靶点”网络 运用Cytoscape 3.8.0软件构建“药材-活性成分-靶点”网络，并进行分析。

1.3 疾病相关靶点及PPI网络 在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)等数据库，以“novel-coronavirus-pneumonia”等为关键词搜索COVID-19疾病靶点，去除重复靶点，Uniprot校正整合，运用Venn 2.1.0获取SJC活性成分作用靶点与COVID-19疾病相关靶点的共有基因，将其导入STRING数据库中，限定物种为人，以高置信度(0.9)为条件筛选，去除孤立靶点，构建PPI网络，并进行分析。

1.4 靶点富集分析 使用R软件，设定阈值P<0.05，进行GO(gene ontology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，绘制柱状图、气泡图和通路网络图，并分析SJC抗COVID-19的生物过程和信号通路。

1.5 “成分-靶点-共有通路”网络构建 通过分析SJC治疗COVID-19的前20条关键信号通路，构建“成分-靶点”和“靶点-共有通路”网络，采用Cytoscape 3.8.0软件中merge功能进行合并，度(Degree)值越高，代表其发挥的作用越大。

1.6 分子对接虚拟筛选 通过TCMSP数据库下载活性成分数据集的mol2格式，通过Chem3D使之能量最小化，转换为pdb格式，导入AutoDock Tools 1.5.6软件，加氢，设置柔性键可旋转，保存为pdbqt格式。从蛋白质结构数据库(PDB，https://www.rcsb.org/)下载SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB ID：6LU7)、S蛋白(PDB ID：6VSB)及ACE2(PDB ID：1R42)的3D结构PDB格式文件，移除水分子和原配体，加氢，保存为pdbqt格式，以潜在活性成分数据集作为配体，靶蛋白为受体，根据作用位点，确定Grid Box的坐标和长宽高，通过AutoDock Vina 1.1.2和Python脚本进行批量分子对接，对对接结果进行分析处理。

2 结果

2.1 活性成分筛选 借助TCMSP数据库和TCMID数据库，通过2次筛选，从1 151个化合物中，最终筛选得到活性化合物179个，其中13个来自败酱草，39个来自板蓝根，17个来自柴胡，92个来自甘草，10个来自虎杖，23个来自连翘，1个来自芦根，12个来自马鞭草。

2.2 “药材-活性成分-靶点”网络 “药材-活性成分-靶点”网络共309个节点和3 883条边，连接较多的可能是关键的活性成分或者靶点，起到枢纽的作用越强[8]，每个活性成分平均与16.90个靶点相互作用，每个靶点平均与19.63个活性成分相互作用，体现了多成分与多靶点共同作用的特点。排名前5位的成分分别是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000358-β-谷甾醇、MOL003896-7-Methoxy-2-methyl-isoflavone、MOL000449-豆甾醇、MOL000006-木犀草素，分别能与77、46、39、39、38个靶点相互作用；排名前5位的靶点是雄激素受体(AR)、雌激素受体(ESR1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、诱导型一氧化氮合成酶(NOS2)、过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARG)分别能与148、148、136、124、118个成分相互作用。白色代表靶点，浅蓝色代表败酱草及其化合物，浅紫色代表板蓝根及其化合物，粉色代表柴胡及其化合物，黄色代表甘草及其化合物，红色代表虎杖及其化合物，浅绿色代表连翘及其化合物，蓝色代表芦根及其化合物，湖蓝色代表马鞭草及其化合物，每条边代表药材中所含化合物与靶点相互作用关系，如图1所示。

图1 疏风解毒胶囊中“药物-活性成分-靶点”网络

2.3 共有靶点及PPI网络构建 去重后获得COVID-19疾病靶点共254个，与SJC中239个作用靶点取交集，结果见图2；通过STRING平台进行PPI网络分析，下载PPI信息，将文件导入Cytoscape软件中，根据网络拓扑参数筛选出，共得到SJC治疗COVID-19的49个关键靶点蛋白，自由度由高到低依次为NF-κB蛋白复合体(RELA)、丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPK3、MAPK1)、炎性介质细胞因子(IL-6)、丝裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)，结果见图3。

图2 疏风解毒胶囊治疗疾病靶点韦恩图

图3 PPI网络

2.4 靶点富集可视化 GO功能富集条目1 330条(P<0.05)，其中生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)条目分别为1 251、31、48条，柱状图见图4。KEGG通路富集条目142条(P<0.05)信号通路，选P值较小的20条通路绘制气泡图，与病毒、细菌感染有关的信号通路有查加斯病、人类巨细胞病毒感染、耶尔森氏菌感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染和利什曼病甲型流感等；与解热、抗炎、免疫调节密切相关的信号通路有糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(AGE-RAGE)信号通路、IL-17信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、Th17细胞分化和HIF-1信号通路等，提示SCJ可能通过抵抗并清除入侵的病原体及已感染的细胞，调控机体免疫系统，降低炎症反应，起到防治COVID-19的作用。选取前10条通路绘制注释网络图，结果见图5。

图4 疏风解毒胶囊治疗新冠病毒肺炎靶标的GO富集分析

图5 疏风解毒胶囊治疗新冠病毒肺炎靶标的KEGG通路富集(A)和注释网络(B)

2.5 “活性成分-靶点-通路”网络构建 SJC治疗COVID-19的前20条关键信号通路涉及的靶点主要包括：PTGS2、NOS2、PPARG、MAPK14和二肽基肽酶-4(DPP4)等22个关键靶点，相关的靶点对应143个成分，主要包括：MOL000098-槲皮素、MOL000006-木犀草素、MOL004328-柚皮素、MOL000497-甘草查尔酮A、MOL000173-汉黄芩素和MOL000422-山柰酚等，体现了各成分是通过多靶点、多信号通路起到治疗的作用，方形代表活性成分，圆形代表作用靶点，箭头代表信号通路，形状越大代表其发挥的作用越大，边代表靶点与活性成分，靶点与信号通路，活性成分与信号通路之间的关系。结果见图6。

图6 疏风解毒胶囊治疗新冠病毒肺炎“成分-靶点-通路”网络

2.6 对接方法可行性验证 移除含有配体的蛋白复合结构中的配体，按设定的参数进行对接，计算对接后构象与原配体结构的均方根偏差值(RMSD)。对接结果表明RMSD均小于0.2 nm，说明该方法准确可行，能较好地重现配体与受体的结合模式。

2.7 分子对接虚拟筛选结果 当结合能≤7.0 kcal·mol-1时，被认为配体与受体结合稳定时能量越低，产生作用可能性较大[9]。分子对接打分值从低到高进行排序见表1～3，SJC中与SARS-CoV-2 3CL水解酶、S蛋白及ACE2结合能数值小于-7.0 kcal·mol-1的分别有130、173、157个化合物。与SARS-CoV-2 3CL水解酶结合较好的分别为MOL005018-夏姆比奥纳(-9.1 kcal·mol-1)、MOL001810-青黛酮(-9.0 kcal·mol-1)、MOL001790-蒙花苷(-8.5 kcal·mol-1)；与S蛋白结合较好的分别为MOL005013-18α-羟基甘草次酸(-10.7 kcal·mol-1)、MOL001790-蒙花苷(-10.6 kcal·mol-1)、MOL001790-新黄烷酮(-10.4 kcal·mol-1)；与ACE2结合较好的分别为MOL005018-夏姆比奥纳(-10.4 kcal·mol-1)、MOL001663-{(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10R,12aR,14bS)-10-羟基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-十四氢萘-4a-羧酸，-9.9 kcal·mol-1}、MOL001810-青黛酮(-9.5 kcal·mol-1)，结合能均远小于临床用药。选取打分前十成分进行分析评价，荷包牡丹碱、青黛酮及新黄烷酮是与SARS-CoV-2 3CL水解酶、S蛋白及ACE2亲和力最强的三个活性成分，以新黄烷酮为例，虚线为氢键，数值为键长，SARS-CoV-2 3CL水解酶为受体，配体羟基可与Gly143形成氢键作用；其他疏水残基如His164、Gln189、Asn142、Glu166等通过与配体疏水环形成较强的堆积作用，更有利于结合；S蛋白为受体，配体羟基可与Pro230形成氢键作用，疏水残基有Phe515、Pro426、Asp428、Ile231；ACE2为受体，配体羟基可与Asn290、Ile291形成氢键作用，疏水残基有Lys441、Ala413、Leu410、Met366，核心活性成分分子对接模式及相互作用二维图见图7～8。

表1 疏风解毒胶囊中活性成分及目前临床用药与SARS-CoV-2 3CL水解酶对接结果

表2 疏风解毒胶囊中活性成分及目前临床用药与S蛋白对接结果

表2(续)

表3 疏风解毒胶囊中活性成分与ACE2对接结果

图7 受体蛋白与疏风解毒胶囊中核心活性成分的分子对接模式

图8 受体蛋白与疏风解毒胶囊中核心活性成分相互作用二维图

3 讨论

预防在此次疫情防控中起着重要的作用，通过判断疾病发展趋势，治疗早于疾病的发生，以防进一步传变，国家诊疗方中，风热犯卫出现乏力伴发热时，使用清热解毒中成药SJC，以在疾病的潜伏期内及早治疗，遏制病情的发展，达到“不治已病治未病，不治已乱治未乱”[10]。

在治疗过程中，其一需强其正气，COVID-19致病原因为“湿毒”所致，方中虎杖作为君药，能除湿、化毒；其二需避其毒气，作为抗病毒的常用药，连翘能解表、祛风；板蓝根具有清热解毒等功效，共为臣药；其三为养其神气，大疫常给人带来恐惧或焦虑等情绪，因疫情丧失亲人，悲伤思念过度而产生抑郁情绪。负性情绪可影响激素和神经递质的分泌，导致免疫力下降，而SJC中柴胡具有舒肝解郁、升举阳气等作用，在药材协同治疗过程中体现了中药复方多成分、多靶点、多通路的特点。

根据PPI网络拓扑筛选的核心靶点主要包括：丝裂原活化蛋白激酶家族成员MAPK1、MAPK3和MAPK14、IL-6和RELA等；当出现感染损伤时，免疫系统应对反应表达IL-6，通过激活Janus激酶/信号转导与转录激活子(Jak/Stat)信号通路，产生免疫细胞，在B淋巴细胞分化、浆细胞形成中起着重要作用[11]。跟炎性因子一样，MAPK在一些应激情况下被激活如炎症反应、肿瘤细胞的增殖分化、病毒感染状态下，MAPK通路调节细胞应对环境的应激变化，主要是通过细胞外信号调节激酶(ERK)、p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)和应激激活蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(SAPK/JNK)3种途径[12]。“活性成分-靶点-通路”网络显示SJC中143个成分通过PTGS2、NOS2、PPARG、MAPK14和DPP4等22个靶点发挥疗效，涉及雌激素应答、免疫炎症、氧化应激、记忆过程、细菌内毒素反应、防御反应及糖皮质激素反应等多个生物过程，参与Th17细胞分化通路、IL-17信号通路及TNF信号通路等，调节免疫炎症因子、单胺类神经递质，起到抑制活化的细胞因子、缓和过激的免疫反应、消除炎症及抗病毒的作用。

Wang等[13]应用单细胞测序识别得到与ACE2共表达的5 556个基因，SCJ中活性成分可能通过影响IL-6、PTGS2、NOS2、MAPK14及DPP4等共有靶点及肾素-血管紧张素系统，激活下游信号通路来促进ACE2的转录和表达，竞争性的影响SARS-CoV-2表达的S蛋白与ACE2结合，减少病毒进入受体细胞的数量，同时抑制SARS-CoV-2 3CL水解酶的活性，减少病毒的复制，从而发挥治疗COVID-19或对COVID-19病程进展的干预作用。分子对接虚拟筛选结果显示，SCJ中共有成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、木犀草素和金合欢素等，与SARS-CoV-2 3CL水解酶结合较好的：山柰酚(-7.8 kcal·mol-1)、槲皮素(-7.7 kcal·mol-1)、木犀草素(-7.6 kcal·mol-1)；与S蛋白结合较好的：木犀草素(-8.8 kcal·mol-1)、豆甾醇(-8.2 kcal·mol-1)、金合欢素(-8.2 kcal·mol-1)；与ACE2结合较好的：β-谷甾醇(-8.8 kcal·mol-1)、豆甾醇(-8.8 kcal·mol-1)、木犀草素(-8.2 kcal·mol-1)，可知共有化合物与相关靶点蛋白形成构象能量低，有较好的亲和作用，与克力芝、阿比朵尔和氯喹等具有相近的结合能。

凌晓颖等[14]研究表明连花清瘟方中山柰酚、槲皮素、木犀草素除了直接抑制病毒复制外，还作用于炎症、免疫等多条信号通路，分子对接结果显示与目前临床报道有效药物具有相近的结合能。已有报道[15-16]，槲皮素、山柰酚具有抗炎、抗菌抗病毒、抗氧化和神经保护等作用；木犀草素用于止咳、祛痰，具有免疫调节、消炎、抗菌、抗病毒等作用，可抑制卵巢癌细胞的增殖及诱导其凋亡[17]。

比较与不同受体蛋白结合结果，荷包牡丹碱、新黄烷酮及青黛酮3个核心活性成分在与不同受体蛋白结合中均具有较好的结合力，导入SwissADME中符合Lipinski类药五规则且结合能远小于目前所报道具有抗SARS-CoV-2的临床用药；有研究报道[18-20]，荷包牡丹碱可以促进气道平滑肌收缩，参与气道形态重塑，同时对肿瘤癌症也有一定作用，诱导人肺腺癌细胞A549凋亡，抑制人高转移性肝癌细胞MHCC97-H及乳腺癌细胞MCF-7的分化及转移。其他较优筛选成分中，由于部分化合物不属于常见成分，目前研究较少，在研究中应加强对此类药物进行发掘利用；通过对接较好的化合物结构比较发现，结构中含有六元环五元环稠合或六元环六元环稠合结构显示出较好的结合能力，可作为小分子药物开发的依据。宋新强等[21]以ACE2为靶点，同样筛选出的中药成分中粗毛甘草素F、新黄烷酮等为抗SARS-CoV-2的核心成分；李婧等[22]以SARS-CoV-2 3CL水解酶为靶点，对接结果显示柴胡皂苷、蒙花苷和β-胡萝卜素等形成构象能量低，较稳定。

综上所述，目前对COVID-19及其致病机制认识不全面，通过高通量组学及生物学方法仍不够准确，中药的化学成分作用靶点及结构尚不完善，存在一定的局限性。应重点对荷包牡丹碱、新黄烷酮及青黛酮等少见的化合物的进行质量控制及药理学研究，进一步的验证，以期为治疗COVID-19提供可参考的依据。