PinX1调控PI3K/Akt信号通路影响口腔鳞癌HSC6细胞的增殖、侵袭和凋亡

邓璐 曾利伟 焦纪兰 江辉

口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是常见的头颈部恶性肿瘤之一，居全球恶性肿瘤的第八位，具有快速增长、侵袭性强和易转移等特性[1]；临床上，手术、放疗和化疗是口腔鳞癌的主要治疗手段，但患者5年生存率仅在65%左右[2]。因此，深入探讨口腔鳞癌的发病机制寻找新的治疗策略是有必要的。人Pin2结合蛋白X1(PIN2-interacting protein X1，PinX1)是一种端粒调控基因，定位于人8p23染色体上[3]。研究[4-6]显示，PinX1在非小细胞肺癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤中常见低表达，与肿瘤临床病理特征和不良预后密切相关。且PinX1可影响细胞增殖、侵袭能力和凋亡水平发挥抑癌作用。口腔鳞癌组织PinX1表达降低与淋巴结转移密切相关[7]。然而，PinX1在口腔鳞癌中的调控作用未见报道。因此，本研究通过开展体外细胞实验，通过观察PinX1对口腔鳞癌HSC6细胞功能的影响及调控机制以揭示PinX1在口腔鳞癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、材料和仪器

人正常口腔上皮细胞株HOEC(上海雅吉生物公司)；口腔鳞癌细胞株HSC6(上海通派生物公司)；胎牛血清、青链霉素混合液(大连宝生物公司)；低糖改良Eagle培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、高糖培养基(roswell park memorial institute，RPMI)-1640培养基(Hyclone公司，美国)；PinX1、增殖核抗原Ki67、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphorylation phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(protein kinase B,p-Akt)、PI3K、AKT和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(Santa Cruz公司，美国)；辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中杉金桥公司)。脂质体2000(广州锐博生物公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司，美国)；胰蛋白酶、蛋白提取试剂盒、细胞计数(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒、膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)；pcDNA3.1-PinX1重组质粒(Invitrogen公司，美国)；二氧化碳细胞培养箱(HERAcell 240i，Heraeus公司，德国)；酶标仪(iMark，Bio-Rad公司，美国)；倒置荧光显微镜(TE2000-E，Nikon公司，日本)；流式细胞仪(Cyto FLEX，Beckman公司，美国)；凝胶扫描系统(GelDoc-It 310，UVP公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 IHC法检测PinX1在OSCC组织中表达 收集手术切除的OSCC组织及癌旁组织样本各30 例，IHC方法检测其中PinX1的表达，比较2 组样本的表达阳性率。

1.2.2 细胞培养 在温度为37 ℃、CO2体积分数为5%和湿度饱和的环境下使用含1%青链霉双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养HOEC细胞；相同环境下采用添加有1%青链霉双抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基常规培养HSC6细胞。

1.2.3 实验分组与HSC6细胞转染 将对数生长期HSC6细胞(2×105个/孔)接种至6 孔细胞板上，置于37 ℃、5%CO2条件下常规培养。实验分为对照组(未转染)、空载体组(转染pcDNA3.1空载体)、PinX1组(转染pcDNA3.1-PinX1重组质粒)和PinX1+IGF-1组(转染pcDNA3.1-PinX1重组质粒后，用100 ng/ml的IGF-1处理20 min)，每组设置3 个平行孔。待细胞达70%～80%汇合度时，参照脂质体2000说明书步骤根据实验分组将pcDNA3.1-PinX1重组质粒和pcDNA3.1空载体转染至HSC6细胞中。转染5 h后更换培养基，再继续培养48 h后收集各组细胞，并采用免疫印迹法检测各组细胞中PinX1蛋白的表达水平以评价转染效果。

1.2.4 CCK-8法检测HSC6细胞增殖 将PinX1+IGF-1组、PinX1组、空载体组和未转染的对照组细胞以每孔105个接种至96 孔细胞板上，每组设置3 个复孔。置于37 ℃、5%CO2条件下常规培养1～4 d。培养至所需时间后，参照CCK-8试剂盒说明书上酶标仪检测细胞的光密度值，其中检测波长为450 nm。重复检测3 次。

1.2.5 Transwell小室检测HSC6细胞侵袭 将基质胶稀释为1 mg/ml，取60 μL浓度平铺在Transwell小室上下室间的聚碳酸酯微孔膜(孔径为8 μm)，室温下自然融合。以无血清培养基调整PinX1+IGF-1组、PinX1组、空载体组、对照组细胞浓度为104个/mL。在Transwell小室上室和下室内分别加入细胞悬液200 μL/孔，含血清的RPMI-1640培养基600 μL/孔，且每组设置3 个平行孔。置于37 ℃、5%CO2条件下常规培养24 h后，取出小室，小心拭去上室内残留的细胞，4%多聚甲醛固定聚碳酸酯微孔膜下表面附着细胞30 min，再以0.1%结晶紫染色15 min。显微镜下观察并统计各组中的穿膜细胞数。实验重复3 次。

1.2.6 流式细胞仪检测HSC6细胞凋亡 收集PinX1+IGF-1组、PinX1组、空载体组、对照组细胞，每组设3 个平行孔。经磷酸缓冲液洗涤2 次后，参照凋亡检测试剂盒说明书进行凋亡检测。实验重复3 次。

1.2.7 免疫印迹法检测HSC6细胞中PinX1、Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达 向HOEC细胞、各组HSC6细胞中加入细胞裂解液提取总蛋白。变性蛋白，取50 μg加入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。蛋白分离后，电转至聚偏二氟乙烯膜上。先用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h，再以一抗工作液(PinX1 1∶100、Ki67 1∶500、MMP-9 1∶800、Bcl-2 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000)在4 ℃下孵育24 h，最后以二抗(1∶2 000)室温孵育2 h。加入化学发光剂，暗室显影曝光。采用凝胶扫描系统分析待测细胞中Ki67、PinX1、MMP-9和Bcl-2蛋白表达量。实验重复3 次。

1.3 数据分析

2 结 果

2.1 PinX1在口腔鳞癌组织和HSC6细胞中的表达及转染效果

PinX1在口腔鳞癌组织中的表达见图 1。口腔鳞癌组织PinX1蛋白阳性表达率为13.33%，癌旁组织为83.33%(P<0.05)。免疫印迹法检测结果显示，人口腔鳞癌HSC6细胞中PinX1蛋白的表达水平(0.24±0.03)明显低于人正常口腔上皮HOEC细胞(0.68±0.05)(图 2A)；转染后各组细胞中PinX1蛋白的表达结果显示，与对照组相比，PinX1组细胞中PinX1蛋白的表达水平明显升高(P<0.05)，而空载体组细胞中PinX1蛋白的表达水平无明显改变(P>0.05)(图 2B，表 1)。

2.2 PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞增殖的影响

空载组从1 d至4 d细胞的增殖活力与对照组直接无明显差异(P>0.05)，但PinX1组从2 d开始细胞增殖活力较对照组明显降低(P<0.05)(表 2)。

图 1 PinX1在口腔鳞癌和癌旁组织中的表达 (IHC, ×200)

图 2 PinX1蛋白在HSC6细胞中的表达

表 1 各组细胞中PinX1蛋白表达水平的比较 (相对灰度值，

表 2 PinX1过表达对HSC6细胞450 nm处光密度值的影响

2.3 PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞侵袭的影响

图 3和表 3结果显示，空载体组中侵袭细胞数与对照组相比差异不显著(P>0.05)，但PinX1组中侵袭细胞数较对照组明显降低(P<0.05)。

图 3 Transwell实验检测各组细胞侵袭能力

2.4 PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞凋亡的影响

图 4和表 3结果显示，与对照组相比，PinX1组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)，但空载体组与对照组比较细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。

图 4 流式细胞仪检测PinX1过表达对HSC6细胞凋亡的影响

表 3 PinX1过表达对HSC6细胞侵袭和凋亡的影响

2.5 PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表达的影响

图 5和表 4结果显示，与对照组相比，PinX1组细胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达水平均明显降低(P>0.05)，但空载体组中这3 项指标无明显改变(P>0.05)。

2.6 PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞中PI3K/Akt信号通路表达的影响

与对照组比较，PinX1组HSC6细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达显著降低，但空载体组中p-PI3K和p-Akt蛋白表达无显著变化(表 5)。

图 5 免疫印迹法检测各组HSC6细胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达

表 4 PinX1过表达对HSC6细胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表达的影响

表 5 PinX1过表达对HSC6细胞中PI3K/Akt信号通路表达的影响

2.7 激活PI3K/Akt信号通路能逆转PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞生物学行为的影响

与PinX1组比较，PinX1+IGF-1组HSC6细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达升高(表 6)；与PinX1组比较，PinX1+IGF-1组HSC6细胞凋亡率降低，侵袭细胞数升高，从2 d开始HSC6细胞增殖活力升高，Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)(表 7～8)。

表 6 IGF-1对HSC6细胞中PI3K/Akt信号通路激活的影响

表 7 激活PI3K/Akt信号通路逆转PinX1过表达对HSC6细胞增殖、侵袭、凋亡的影响

表 8 激活PI3K/Akt信号通路能逆转PinX1过表达对口腔鳞癌HSC6细胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨 论

端粒是染色体末端一种DNA蛋白质复合物，在维持基因组稳定性和调控细胞增殖、凋亡等过程中发挥着重要作用；端粒酶可维持端粒稳定性，被认为是肿瘤发生发展过程中的关键酶[7]。PinX1是一种端粒酶强效抑制剂，其在肿瘤中的作用逐渐引起关注，Feng等[8]发现，PinX1在基底样乳腺癌组织中异常低表达，且与肿瘤组织学分级、侵袭性密切相关；PinX1的过度表达抑制了基底样乳腺癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡。然而Kang等[9]指出，PinX1在间变性甲状腺癌组织和细胞中的表达水平明显高于乳头状甲状腺癌，促进甲状腺癌的细胞增殖、迁移和分化进程，发挥着类似致癌基因的作用。PinX1在不同类型的癌症中发挥不同的作用。本研究观察到口腔鳞癌HSC6细胞PinX1表达水平较正常口腔上皮HOEC细胞明显降低，而成功上调PinX1表达明显增强HSC6细胞凋亡能力，减弱增殖、侵袭能力。这提示PinX1可通过调控癌细胞生物学功能在口腔鳞癌中发挥着重要作用。

Ki67是一种细胞增殖核蛋白，常被作为口腔鳞癌细胞增殖的标记物[10]；MMP-9是维持细胞外基质降解和重塑的动态平衡中的一种基质金属蛋白酶，与口腔鳞癌细胞增殖和转移密切相关[11]；在细胞凋亡研究中Bcl-2是最受重视的癌基因之一，其在口腔鳞癌细胞凋亡过程中发挥着重要的抑制作用[12]。Liu等[13]研究指出，膀胱尿路上皮癌组织中PinX1表达显著下调，且与Ki67表达呈现负相关。赵杨等[14]发现，低表达的PinXl可能通过引起MMP-9通路激活促进黑色素瘤细胞的迁移和侵袭。申聪香等[15]指出，PinX1可通过下调Bcl-2表达提高鼻咽癌细胞对顺铂的化疗敏感性。本研究进一步检测发现，上调PinX1可降低口腔鳞癌HSC6细胞中Ki67、MMP-9和Bcl-2蛋白的表达，这与功能分析实验结果相一致。提示PinX1在口腔鳞癌中发挥抑癌基因作用。

PI3K/AKT作为一种重要细胞内信号转导通路，其已被证实在口腔鳞癌等多种类型恶性肿瘤激活，参与肿瘤转移[16]。抑制PI3K/AKT信号通路可降低口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[17]。本研究显示，PinX1可降低p-PI3K和p-Akt的表达水平，阻断PI3K/AKT信号通路，而使用IGF-1激活PI3K/AKT信号通路则逆转过表达PinX1对HSC6细胞增殖、侵袭、凋亡以及其相关蛋白表达的影响。提示，PinX1通过抑制PI3K/AKT信号通路在口腔鳞癌中发挥作用。

总之，PinX1通过抑制PI3K/AKT信号通路可抑制口腔鳞癌HSC6细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。该结果丰富了口腔鳞癌发生发展的分子机制，为PinX1作为口腔鳞癌治疗的新靶点提供了参考依据。