柠檬精油对白假丝酵母菌在纯钛义齿支架表面黏附的影响
2021-10-19张学思张向宇
张学思 张向宇
义齿性口炎是指戴有活动义齿者的义齿基托下黏膜局部或弥漫性炎症。研究表明大约90%的义齿性口炎是由真菌引起的，其中最主要为白假丝酵母菌(C.albicans)，义齿性口炎患者C.albicans的检出率为60%～100%[1-2]。
柠檬精油(LEO)是在水果柠檬中提取的一种淡黄色液体，本研究通过比较LEO与0.2%氯己定溶液(0.2%Chlorhexidine，0.2%CHX)、3%碳酸氢钠溶液(3%NaHCO3)对C.albicans在纯钛义齿支架表面黏附的清洁和洗脱作用效果，进而探讨其用于预防和辅助治疗义齿性口炎的可行性,以期实现口腔疾病的生态防治。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
纯钛试件(北京市海龙达义齿研究所)；LEO(广州东方生物科技股份有限公司)；PBS缓冲液(福州飞净生物科技有限公司)；0.2%氯己定消毒液(福建维真园医药科技有限公司)；3%碳酸氢钠溶液(青岛华洁清洁用品有限公司)；牛血清白蛋白BSA(上海金穗生物科技有限公司)；电热恒温培养箱(天津市中环实验电炉有限公司)；DL-CJ-2N医用型洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；紫外分光光度计(Eppendorf，德国)；激光共聚焦显微镜(Olympus公司，日本)；医用离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；旋涡震荡器(SI Vortex-Genie2，Scientific Industries公司，美国)。
1.2 材料准备与分组
材料：纯钛试件，制备成7.5 mm×8 mm×2 mm 标本；LEO。实验分组：实验组：LEO(A)、50%LEO(B)；阳性对照组：0.2%CHX(C)、3%NaHCO3(D)；空白对照组：无菌蒸馏水(E)。实验共分5 组，每组12 个钛板。
1.3 方法
1.3.1C.albicans菌液制备 将菌种接种于沙氏液体培养基中培养48 h，PBS缓冲液稀释成1×108CFU/ml,备用。
带菌试件的制备 配置含1%小牛血清蛋白的PBS液，将纯钛试件放入浸泡10 min。试件取出置于24 孔板中，每微孔加入1 mL菌液、1 mL沙氏液体培养基和0.1 mL牛血清蛋白液，37 ℃恒温箱培养48 h，使C.albicans在试件上充分生长黏附。
取出试件，1 mL PBS液轻轻漂洗3 次，分别放入上述各组中，室温下浸泡6 h[3]。将浸泡后的试件取出后，PBS液轻轻冲掉表面药物，放入每孔含2 mL液体沙氏培养基的24 孔板中，37 ℃恒温箱培养48 h。
1.3.2 抑菌效果评价
1.3.2.1 分光光度计检测 每组随机抽取试件各8 块，PBS溶液漂洗3 次，洗去表面未黏附的C.albicans，将试件放入含有1 mL PBS溶液的试管中，放置在旋涡振荡器上震荡90 s，使黏附在试件表面的菌体充分洗脱于PBS溶液中，分光光度计测定洗脱液A600 nm值。
1.3.2.2 菌落计数 每组中随机抽取2 块试件，PBS液漂洗3 次，置于含有5 mL无菌生理盐水的试管中，在旋涡振荡器上震荡90 s，无菌生理盐水将其10 倍稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同浓度的稀释液0.1 mL涂布于沙氏固体培养基表面，每个稀释浓度做3 个平行样本。37 ℃恒温培养箱中培养48 h后菌落计数，计算均数。
激光共聚焦显微镜观察 随机选取每组2 块试件，PBS液漂洗3 次，AO/EB(吖啶橙/溴乙锭)染色，激光共聚焦显微镜下观察生物膜形态。
1.4 统计方法
2 结 果
2.1 各实验组洗脱菌液
A值平均值结果如下: 0.2%CHX组
a vs b， P<0.05； a vs c, P<0.05； b vs c, P<0.05； ac vs a or c, P>0.05
2.2 菌落计数结果
比较细菌生长情况，排除菌落数过高或过低值，选取稀释到10-2浓度时所划平板的菌落数进行比较分析，菌落数3%NaHCO3组<0.2%CHX组
2.3 激光共聚焦显微镜观察各组
药物处理后C.albicans在钛板上的黏附状态。结果示: 无菌蒸馏水组钛板表面几乎全部为活菌，死菌比例最小；50%LEO组死菌比例明显增多；LEO组、0.2%CHX、3%NaHCO3组钛板表面死菌数目明显多于活菌。表明LEO可以降低C.albicans在纯钛试件表面的黏附量，与2.1和2.2实验结果一致(图 3)。
图 2 各组菌落个数比较(稀释到10-2浓度)
3 讨 论
义齿性口炎临床表现为承托区黏膜呈猩红色或点状出血，红斑，有伪膜，患者自觉口干，有烧灼感，咀嚼疼痛，无法正常进食。义齿性口炎的主要病因是真菌和细菌感染，最主要是C.albicans感染。研究表明，在义齿微生物的黏附实验中C.albicans检出率是69.7%，变形链球菌和金黄色葡萄球菌的共同检出率是45.3%[4]。C.albicans为机会致病菌，可存在于健康人的口腔、消化道、阴道等，在宿主防御功能降低时可致病。C.albicans主要聚集在义齿的组织面及相对应的病损黏膜上，通过黏附、侵入上皮细胞，引起口腔黏膜感染。致病机制主要为：(1)细胞壁黏附物质：C.albicans细胞壁的主要成分是甘露聚糖-蛋白质，其为疏水性并可通过与黏膜和义齿材料的疏水端的相互作用来促进其黏附[5]；黏附素也是介导C.albicans对口腔黏膜黏附作用的主要物质，代表性的有Als1、凝集素样黏附素1、菌丝孔蛋白1等[6]；(2)C.albicans可产生多种侵袭酶，破坏宿主细胞的细胞膜，其蛋白酶的活性与毒力呈线性正相关[7],其中主要致病的是分泌型细胞外酸性蛋白酶，它将蛋白质分解作为氮源在皮肤及深部组织中定植，并可将白蛋白、角蛋白、血红蛋白和凝血因子等分解使C.albicans在组织中更容易扩散；(3)C.albicans还可以通过酵母相和菌丝相两种表型的转换来达到致病性，C.albicans的菌丝具有更强的致病性，在义齿性口炎患者中检出率非常高[8]。
图 3 各组激光共聚焦显微镜下C.albicans的黏附状态
义齿性口炎的形成与基托材质和光滑度有关。微生物在数小时内就能黏附于义齿基托材料上，24 h后达高峰，在树脂基托表面的黏附量显著高于金属表面[9]。C.albicans黏附于不同金属材料的能力也不同，有学者研究了钴铬合金和纯钛金属材料的可摘局部义齿修复牙列缺损后的咀嚼功能、牙龈状态、义齿性口炎的发生等情况，发现纯钛均优于钴铬合金，可能是因为纯钛表面较高的自由能和TiO2成分[10]。纯钛有良好的物理性能，低密度，所制作的基托轻便，异物感小，患者戴用舒适，对发音影响小，有利于余留牙和口腔黏膜的保健；纯钛支架不会引起口腔黏膜类似排斥的反应，如微血管流速的变化、组织液渗出的增加等；无致畸致癌性，生物相容性好。纯钛铸件越来越多被口腔医生所选择。
对义齿支架表面C.albicans的清除和抑制在预防和减少义齿性口炎方面具有重要意义。理想的义齿清洁剂需要有很强的杀菌能力，对口腔黏膜无刺激性，对义齿支架表面无损伤。目前义齿清洁剂根据作用机理可分为碱性过氧化物类、碱性次氯酸盐类、酶类等[11]，过氧化物类遇水反应生成活性氧而起到杀菌作用，同时生成气泡可以达到物理清洁作用，酶类可以破坏菌斑附着，抑制菌斑形成，但没有一种成分能达到理想的清洁效果。研究显示，长期使用义齿清洁剂会对义齿的色泽、气味、弹性等物理化学性能产生影响[12]。
天然药物因为来源丰富、取材方便、生物安全性较好引起国内外学者的广泛关注和研究[13]。LEO是在水果柠檬中提取的一种淡黄色液体，有天然的清香气味。LEO含量最多的成分柠檬烯可以抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等细菌[14]，对黑曲霉菌、黄曲霉菌及青霉菌等真菌也有较强的抑制作用[15]，研究发现柠檬烯具有抗牙龈卟啉单胞菌的作用[16]。本项目前期研究发现LEO有抑制C.albicans生长的作用，而且在应用浓度未发现毒副作用。柠檬精油可以降低变形链球菌乳酸脱氢酶活性减少酸的产生，减少龋病发生[17]。体外研究发现其可以抑制变形链球菌对牙体等硬组织表面的黏附[18-19]。具有开发成口腔辅助用品的潜能。
本研究探究了LEO对C.albicans在纯钛义齿支架表面黏附的影响和洗脱作用，结果表明LEO可以降低其在可摘义齿表面的黏附，对于预防义齿性口炎发生，可能具有重要研究价值。本实验采用的是体外研究LEO对C.albicans的作用效果，与口内复杂的生态环境差距较大，今后将进一步进行口内实验等深入研究。
