糠醛渣与磺化糠醛渣复合材料固定HRP降解苯酚

毕淑娴，郝红英，雷文雅，詹海鹃，刘万毅

(省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室 化学国家级实验教学示范中心宁夏大学 化学化工学院，宁夏 银川 750021)

酚类化合物是工业上常见的有毒有机污染物，含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一，它的大量排放对土壤和水体造成严重的污染，严重危害动植物和人类的健康[1]。随着工业的发展，含酚废水的种类与数量都日益增加，废水治理也是科学工作者急需解决的环保问题[2-3]。辣根过氧化物酶(HRP)是一种从植物中提取出来的过氧化物酶[4]，在过氧化氢或其他有机过氧化物存在下，可以催化芳香族化合物的氧化，被广泛应用于有机合成、聚合物合成、含酚类化合物废水的处理等各个方面[5-6]。所谓固定化酶，是指通过物理或化学方法将酶固定在一定空间范围内，酶仍能保持其高效的催化性能，并能反复、连续使用的酶[7-9]。与游离酶相比，固定化酶具有保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性，寻找高效恰当的载体材料和有效的固定方法仍是该领域值得研究的大问题。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

糠醛渣，工业级；壳聚糖(CTS)、辣根过氧化物酶均为生化试剂；冰乙酸、戊二醛、4-氨基安替比林、苯酚、30%过氧化氢、无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯；纯净水(1.5 L，娃哈哈)。

PSHJ-5酸度计；UV-1800PC紫外分光光度计；KQ-250E超声波清洗器；BC/BD-111HC冰箱；JD200-4电子分析天平；SHA-C数显恒温振荡器；KA-1.0离心机。

1.2 两种交联糠醛渣材料的制备

1.2.1 糠醛渣复合材料制备 称取1 g糠醛渣(40～60 m)，加入10 mL 3%的壳聚糖溶液，磁力搅拌12 h，静置。倒去上清液，洗涤至中性，过滤，在 80 ℃ 烘干。轻微研磨，得FR-CTS材料。

1.2.2 磺化糠醛渣复合材料制备

1.2.2.1 糠醛渣的磺化 称1 g糠醛渣(40～60目)于釜内胆，边磁力搅拌，边滴加3 mL浓硫酸，搅拌30 min，静置48 h。于烘箱内150 ℃下反应 4 h，冷却至室温。水洗至中性，过滤，将其在80 ℃烘干。轻微研磨，得磺化糠醛渣材料SFR。

1.2.2.2 SFR-CTS材料制备 称取1 g磺化糠醛渣，加入10 mL 3%的壳聚糖溶液，磁力搅拌12 h，静置。倒去上清液，洗涤至中性，过滤，在80 ℃烘干。轻微研磨，得SFR-CTS材料。

1.2.3 交联糠醛渣材料的制备 称取FR-CTS材料和SFR-CTS渣材料各1 g，加入20 mL 3%的戊二醛溶液，磁力搅拌8 h，静置。洗去多余的戊二醛，洗涤3～5次，置烘箱80 ℃烘干，研磨，得到交联糠醛渣复合材料(FR-CTS-GA)和交联的磺化糠醛渣复合材料(SFR-CTS-GA)。

1.3 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA固载酶的制备

1.3.1 0.1 mol/L pH=5.0，6.0，7.0，8.0，9.0磷酸盐缓冲液配制 分别称取磷酸氢二钠17.91 g，磷酸二氢钠7.801 g，溶解于500 mL去离子水。使用时按比例混合，并调节到相应pH。

1.3.2 1 mg/mL辣根过氧化物酶溶液配制 准确称取10 mg 辣根过氧化酶，溶解于10 mL pH=7.0磷酸盐缓冲液中。分装在数个离心管中，置于冰箱冻存。使用时稀释到相应比例。

1.3.3 固载酶的制备 分别准确称取10 mg FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA用pH=7.0磷酸盐缓冲液定容至10 mL，超声处理5 min，得到1 mg/mL均一的FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA水溶液。分别加入0.2 mg/mL HRP酶溶液和pH=7.0 的磷酸盐缓冲液，将各样品混合均匀后密封，在冰浴条件下置于恒温振荡器上固载2 h。

1.4 HRP酶催化降解苯酚

1.4.1 0.8 mol/L苯酚溶液50 mL配制 称取 3.765 g 苯酚，依次加入12.5 mL 无水乙醇，37.5 mL pH=7.0 磷酸盐缓冲液，置于棕色试剂瓶冷藏保存。

1.4.2 39.3 mmol/L 4-氨基安替比林50 mL配制 称取0.399 g 4-氨基安替比林，加入50 mL去离子水，置于棕色试剂瓶中冷藏保存(每隔1周重新配制1次)。

1.4.3 30 mmol/L过氧化氢50 mL配制 取30%(m/m)过氧化氢155 μL，去离子水定容至50 mL，置于棕色试剂瓶中冷藏保存(每隔1周重新配制1次)。

1.4.4 苯酚的催化降解 pH=7.0条件下，加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mo/L过氧化氢，再加入pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，使得整个反应体系为1 mL，在30 ℃下降解反应12 h，考察苯酚去除率。

2 结果与讨论

2.1 载体的表征

2.1.1 FR和SFR-CTS-GA的红外谱图 见图1。

图1 FR和SFR-CTS-GA的红外谱图

2.1.2 糠醛渣和磺化糠醛渣复合材料的光电子能谱 糠醛渣和磺化糠醛渣复合材料的光电子能谱见图2～图4。

图2 糠醛渣的光电子能谱图

图3 FR-CTS-GA的光电子能谱

图4 SFR-CTS-GA的光电子能谱

根据能谱中特征峰扫描谱的峰面积，结合灵敏度因子，可求得糠醛渣、FR-CTS-GA、SFR-CTS-GA表面各组分的原子个数比及质量比，其定量分析结果见表1。

表1 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA光电子能谱元素分析

由谱图及光电子能谱元素分析可知，糠醛渣、FR-CTS-GA、SFR-CTS-GA均检出C、O、N元素，其中O 1s元素含量分别为31.86%，30.53%，29.11%，C 1s 元素含量分别为67.75%，68.32%，66.42%，SFR-CTS-GA检出S元素，接入了磺酸基，成功磺化。

图5为FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA表面C 1s的高分辨波谱。

图5 FR-CTS-GA和SFR-CTS-GA表面C 1s的高分辨波谱

由图5可知，C 1s有4个峰：C Ⅳ(281 eV)，脂肪烃碳原子；C Ⅱ(282.3 eV)，与酚类、醇类、醚类相连的碳；C Ⅲ(283.3 eV)，羰基中碳；C Ⅰ(285.8 eV)，碳酸盐或吸附的CO和CO2中的碳。

2.2 HRP的固载

2.2.1 固载酶的热稳定性 温度是酶在使用过程中影响其使用效果的重要因素之一，温度的变化会影响到酶的结构，进而影响到酶活性。因此需要考察不同温度下游离酶和固载酶的的酶活力。取游离酶和两种固载酶样品各5个，在其余条件不变的前提下，在20～60 ℃的温度范围内测定各样品活性，以相对酶活为纵坐标作图，结果见图6。

图6 温度对固载及游离酶的影响

由6图可知，游离酶在40 ℃时酶活性最高， SFR-CTS-GA固载酶和FR-CTS-GA固载酶最高酶活性也在40 ℃。在高温时，固载酶的热稳定性较游离酶有了提高，这可能是由于高温时游离酶的酶构象发生变化，导致活性丧失，而固载酶避免了在热量传导过程中造成酶结构变形或损坏。

2.2.2 固载酶的时间稳定性质 取两种固载酶平行样品，在0.1 mol/L、pH 7.0磷酸盐缓冲液中于 4 ℃ 冷藏避光保存，每隔一段时间取出进行酶活测定，结果见图7。

图7 储存时间对固载的影响

由图7可知，两种固载酶的半衰期为10 d，储存稳定性较好，FR-CTS-GA固载酶的稳定性相对更好，SFR-CTS-GA固载酶保存15 d后，活性仅为原来的33%，而FR-CTS-GA固载酶在相同条件下，活性降为原来39.7%。这可能是由于交联时戊二醛过量所造成的。两种载体通过戊二醛进行交联之后，本应该稳定性更强，但过量的戊二醛会影响HRP空间结构的稳定性，甚至扭曲HRP的特定活性位点，导致酶的构象发生变化，造成酶活性的下降，还会影响到载体表面结构，导致酶不易被固定。

2.2.3 固载酶的动力学参数 固定测定酶活力溶液中的过氧化氢浓度，只改变苯酚的浓度，其他条件均相同。测定不同的苯酚浓度下的体系的吸光度，转换为酶促反应速率，以苯酚浓度的倒数为横坐标，测得的反应速率的倒数为纵坐标作图求得Km值。三种酶样品的Lineweaver-Burk曲线见图8。

图8 游离酶与固载酶的Lineweaver-Burk曲线

由表2可知，游离酶与固载酶的Km值相对大小为FR-CTS-GA固载酶

表2 游离酶与固载酶动力学参数

2.3 HRP酶催化降解苯酚

2.3.1 温度的影响 pH=7.0条件下，加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 过氧化氢，再加入pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，使得整个反应体系为1 mL，分别在20，30，40，50，60 ℃条件下反应12 h，考察苯酚去除率随温度的变化趋势，结果见图9。

图9 温度对固载及游离酶降解苯酚的影响

由图9可知，40 ℃之前游离酶和固载酶对苯酚的去除率都随温度上升而增加，40 ℃之后游离酶的去除率开始迅速下降，这是由于在较高温度时，游离酶的活性大大降低的缘故；固载酶对苯酚的降解率整体高于相应温度下游离酶对苯酚的降解率，说明酶固定化后所得的固载酶具有耐高温性，在温度较高时，依然可以保持较好的性能。去除率随温度的变化趋势与酶活性随温度的变化趋势一致，说明苯酚去除率的变化主要与酶活性随温度变化有关。

2.3.2 pH的影响 固载后的HRP对pH稳定性高，在pH=4～10都有一定催化活性。加入10 μL 0.08 mol/L苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 过氧化氢，分别加入pH=5～9的缓冲溶液使整个反应体系为1 mL，在30 ℃下降解反应12 h，pH对苯酚去除率的影响见图10。

图10 pH对固载及游离酶降解苯酚的影响

由图10可知，苯酚降解率随pH增大而增大，在pH=8时达到最大降解率，随后降解率随pH增大而减小。而固载酶对苯酚的降解率整体受pH的影响较小，碱性条件下，固载酶对苯酚的降解率高于游离酶对苯酚的降解率。

2.3.3 苯酚浓度的影响 分别加入5，10，15，20，25，30 μL浓度为0.08 moL/L的苯酚溶液，10 μL 0.1 mol/L 过氧化氢，再加入pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，使得整个反应体系为1 mL，在30 ℃下降解反应12 h，苯酚去除率随着苯酚初始浓度的变化见图11。

图11 浓度对固载及游离酶降解苯酚的影响

由图11可知，随着苯酚初始浓度增加，固载酶对苯酚的催化去除逐渐降低。总体来看，固载酶比游离酶受苯酚浓度影响较小，SFR-CTS-GA固载酶催化降解苯酚的效率更高。由此可知，固定化酶适宜处理低浓度含酚废水，对于高浓度含酚废水，还需进行预处理，使苯酚浓度降低，再进行二级处理，达到排放要求。

3 结论

以糠醛渣和磺化糠醛渣为载体，与壳聚糖组合，形成复合材料，使用戊二醛作为交联剂，对复合载体材料进行交联，与适当浓度的HRP酶液混合，冰浴振荡得到固载酶。固载酶在pH=7，40 ℃时有最高活性，在高温条件下，固载酶活性高于游离酶，两种固载酶在使用完第一次后活性就大大降低，而总体来看，SFR-CTS-GA固载酶的重复利用效果更好一些。固载酶在pH=8，40 ℃条件下对苯酚的催化效率最高，固载酶具有更宽的pH适用范围，碱性条件下，固载酶对苯酚的降解率高于游离酶。在高温条件下，两种固载酶对苯酚的催化能力优于游离酶。苯酚起始浓度为1.6 mmol/L，在30 ℃下反应12 h，SFR-CTS-GA固载酶和FR-CTS-GA固载酶对苯酚的去除率可以达到92%，85%。