注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定茶叶中24种农药残留

马佳丽，王晨，陈红平，柴云峰，诸力，刘新

注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定茶叶中24种农药残留

马佳丽1,2,3,4，王晨1,3,4*，陈红平1,3,4，柴云峰1,3,4，诸力1,3,4，刘新1,3,4*

1. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081；3. 农业农村部茶叶质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 310008；4. 农业农村部茶叶产品质量安全风险评估实验室（杭州），浙江 杭州 310008

基于茶叶基质特点，开发了注射器内分散固相萃取快速前处理技术，建立了茶叶中24种农药残留超高效液相色谱-串联质谱检测方法。茶叶样品经乙腈提取，无水MgSO4盐析，在设计的注射器装置内以丙基乙二胺键合硅胶和石墨化炭黑作为分散吸附剂进行净化，超高效液相色谱-串联质谱法进行检测。在3个添加水平（0.01、0.05、0.5 mg·kg-1）下，红茶和绿茶中24种农药的平均回收率为61.7%～98.8%，相对标准偏差为0.4%～5.5%，准确度和精密度良好。24种农药的红茶和绿茶基质标准工作液线性关系良好，相关系数（2）均大于0.995，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.05～5.36 μg·kg-1和0.18～17.86 μg·kg-1，该方法具有良好的灵敏度。本方法具有简便快捷、所需仪器少、省时等优势，适用于茶叶中多农药残留的定量检测。

茶叶；超高效液相色谱-串联质谱；农药残留；注射器内分散固相萃取

茶叶是一种重要的饮料产品。目前，我国已成为世界上最大的茶叶生产国，在国际茶叶贸易中占有重要地位[1]，同时我国也是世界上最大茶叶消费国。为保障茶叶的产量和质量，在茶树生长过程中需要对病虫草害进行防控。生态化协调发展要求采用以生物防控的技术，而有些茶树种植者往往采用了喷施农药的防控手段，从而导致茶叶中存在农药残留。目前茶叶中新烟碱类、氨基甲酸酯类、有机磷类、三唑类等农药的检出已被广泛报道。陈思敏等[2]在15个茶叶样品中检出11种农药，其中多菌灵、苯醚甲环唑和哒螨灵的检出率大于60%且残留量较高；余璐等[3]在茶叶样品中检测出15种农药，其中包括噻嗪酮、啶虫脒和三唑磷。

目前，茶叶中农药残留的分析方法主要有气相色谱法[4-5]、液相色谱法[6-7]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[8-10]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[11-13]等。多农残检测通常采用通用性强、选择性好、灵敏度高的GC-MS/MS和LC-MS/MS法，尤其LC-MS/MS法对茶叶农药残留的检出限可达到ng·kg-1水平。茶叶作为一种高度复杂的基质，富含嘌呤碱、多酚和一些特有的色素。其在样品前处理阶段易与目标农药一同提取，导致直接干扰和基质效应，因此茶叶农药残留检测方法的开发与改进主要聚焦于前处理技术。传统的前处理方法，如固相萃取[14-15]、基质固相分散[4,16]、凝胶渗透色谱[17-18]等，虽然能够有效去除茶叶中的共萃取物质，但十分耗时、有机溶剂用量大且前处理设备昂贵，无法满足对茶叶农残检测便捷、快速、低成本、高通量等的需求。一些新型前处理方法利用注射器进一步简化了操作，例如注射器内分散固相萃取（IS-dSPE）、快速滤过型净化（m-PFC）等。其中IS-dSPE法凭借注射器特有的活塞推拉操作避免了费时的离心步骤和大量的开关盖操作，实现高通量的同时简化了操作，提高了前处理的效率。该方法已在蜂蜜[19]、河水[20]、鱼[21]等的农药多残留检测中成功运用，但在茶叶中应用较少。

因此，本研究选择了茶叶中检出率高的24种农药，其中16种农药我国已制定限量标准，其余8种暂未制定限量但应用较为广泛。以IS-dSPE法为基础，进一步调整了注射器装置，优化了质谱参数、提取条件、净化条件、离心以及涡旋时间，以其建立具有简单、快速、准确和高通量等优点的检测方法，适用于茶叶中多农药残留的快速检测，保障茶产品的安全质量。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津公司）-AB Sciex TQ 5500三重四极杆质谱仪（美国Sciex公司），串联使用；DMT-2500多管涡旋混合仪（杭州米欧仪器有限公司）；涡旋混匀仪[大龙兴创试验仪器(北京)股份公司]；4-16KS冷冻离心机（德国Sigma公司）；5 mL一次性使用无菌带针注射器（江苏治宇医疗器材有限公司）；6 mL固相萃取（SPE）柱管及筛板（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。

24种农药标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司和上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈、甲醇（HPLC级）均购自美国FIsher公司；-丙基乙二胺键合硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、多壁碳纳米管（MWCNTs）均购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；交联乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）购自美国Sigma-Aldrich公司；无水硫酸镁（MgSO4）购自北京百灵威科技有限公司；尼龙滤器（孔径0.22 μm，直径13 mm）购自上海安谱实验科技股份有限公司；试验用水由Milli-Q试验室水纯化系统（美国Millipore公司）纯化制得。茶叶样品均为市售茶叶。

1.2 样品前处理

将5 mL注射器拆解，取其中的活塞和针头；在6 mL SPE柱管中加入筛板，在筛板上部填充100 mg PSA与25 mg GCB的组合吸附剂，将活塞从SPE柱管上部缓慢推到底，下部接上针头，即获得本研究所使用的组装注射器。分散固相萃取注射器如图1所示。

称取2.00 g（精确至0.01 g）粉碎的茶叶试样于50 mL离心管，加入5 mL去离子水，浸泡30 min，加入10 mL乙腈，充分涡旋振荡30 s，加4 g无水MgSO4，涡旋振荡30 s，以7 500 r·min-1离心5 min。吸取上清液1 mL至装有100 mg PSA、25 mg GCB吸附剂的组装注射器内，充分涡旋振荡30 s，缓慢推动注射器活塞，滤液直接经尼龙滤器过滤，待超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析。

1.3 农药标准溶液的配制

混合标准溶液：准确称取各农药标准品20.0 mg于20 mL容量瓶中，以乙腈溶解并定容至刻度，配成1 000 mg·L-1的标准储备液，–18℃以下贮存。以乙腈稀释至所需浓度，得到混合标准溶液。

混合标准工作液：取适量的混合标准溶液，以茶叶空白样品经1.2章节处理得到基质溶液稀释至1 mL，配置浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg·L-1基质标准工作液。

图1 分散固相萃取注射器示意图

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱采用Waters Acquity HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流动相：A相为含0.1%甲酸及1 mmol·L-1甲酸铵水溶液，B相为含0.1%甲酸及1 mmol·L-1甲酸铵的甲醇溶液。流动相梯度洗脱程序：0～1 min，保持10% B；1～2 min，变为70% B；2～6 min，变为98% B；6～8 min，保持98% B；8～8.1 min，变为10% B；8.1～14 min，保持10% B；流速：0.3 mL·min-1；进样量：1 μL；柱温：40℃；运行时间：14 min。

质谱条件：采用电喷雾正离子源模式（ESI+）；气帘气（Curtain gas）压力241.3 kPa；碰撞气（Collision gas）压力48.3 kPa；喷雾电压5 500 V；雾化温度500℃，雾化气（GS1）压力334.7 kPa；辅助气（GS2）压力334.7 kPa。监测模式：多反应监测（MRM）。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

以乙腈配制质量浓度为0.1 mg·L-1的24种目标化合物标准溶液，经针泵注射进样，采用电喷雾正离子模式进行质谱条件优化，质谱优化结果如表1所示。

在选择母离子时，24种目标化合物中23种皆以[M+H]+为母离子进行了二级质谱优化。水胺硫磷的分子量为289.053 77，其加氢峰[M+H]+（m/z 290）的信号强度很弱，说明离子化效率低，灵敏度难以满足要求。除了分子离子峰[M+H]+外，水胺硫磷还存在加氢脱氨基峰[M+H-NH3]+（m/z 273）、加铵峰[M+NH4]+（m/z 307）、加钠峰[M+Na]+（m/z 312）和加钾峰[M+K]+（m/z 328）。母离子全扫时，[M+H-NH3]+、[M+NH4]+、[M+Na]+信号强度较高，而[M+K]+的信号强度很弱，表明水胺硫磷与钾离子的结合能力很弱，不考虑作为母离子。以[M+NH4]+为母离子的离子对经液相色谱分离后峰形较差，分析可能是由于铵离子浓度不稳定造成，不考虑作为母离子。以[M+H-NH3]+和[M+Na]+为母离子的离子对经液相色谱分离后峰形均较好，但[M+H-NH3]+的离子对响应值显著高于[M+Na]+，两者丰度最高的离子对273/230.9和312/270.1的响应值之比为38∶1。因此本研究最终选择[M+H-NH3]+（m/z 273）作为水胺硫磷的母离子，m/z 230.9、m/z 121分别作为其定量和定性子离子。分子结构及碎片离子裂解途径如图2所示。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取条件的优化

本研究采用对所测农药具有较强溶解性的乙腈作为提取溶剂。对于一些氨基甲酸酯类或是强极性的农药，用水浸泡茶叶再经乙腈提取的效率高于用纯乙腈提取的[11,22]。前期试验表明，2 g茶样加入5 mL水浸泡30 min后再经10 mL乙腈提取，更有利于乙腈对茶叶中极性农药的提取，获得稳定的结果。提取时需要加入盐析剂饱和水相，以促使目标农药进入乙腈相，为此本研究比较了3种不同盐处理（即1 g NaCl+4 g无水MgSO4、4 g无水MgSO4、3 g NaCl）对目标农药提取效率的影响。结果发现（图3），23种农药在3种处理下的回收率均在70%～120%，而烯啶虫胺的回收率均低于70%。烯啶虫胺的正辛醇水分配系数（log）为–0.66，水溶性较强，因此导致其易溶解于下层水相中，在提取时损失较大。由于烯啶虫胺回收率在4 g无水MgSO4的处理下相对较高，为60.5%。因此本方法采用5 mL去离子水、10 mL乙腈提取并用4 g无水MgSO4盐析。

2.2.2 注射器装置及吸附剂优化

当注射器内直接装入吸附剂，在吸取提取液后置于混匀涡旋仪上涡旋过程中会出现漏液的现象。经多次试验验证表明，在注射器底部加置筛板后，筛板可起到阻隔液体功能，可保证涡旋时不出现漏液情况。考察PSA、C18、GCB、PVPP和MWCNTs对目标农药的净化效果，用量分别为100、100、50、50、25 mg，以筛选合适的分散固相萃取吸附剂。试验结果如图4-A所示，在PSA和PVPP两个处理下，大部分农药净化效果相对较好，目标农药（烯啶虫胺除外）的回收率皆能保证在70%～120%。其中多菌灵在PSA处理下回收率为71.1%，比净化前提高了7%。并且PSA对于基质效应的改善也优于其他几种吸附剂。

GCB、C18和MWCNTs作为QuEChERS前处理技术中常用的分散固相吸附剂，对基质中的色素具有较强的去除能力，使提取液颜色变浅[23]。该现象在本试验中也得到了证实（图4-B），其中GCB净化后的液体颜色最浅，对茶叶中色素类物质净化效果最好。

从回收率上看，GCB和MWCNTs均对多菌灵存在明显的吸附作用，使其回收率降至60%以下，这与GCB和MWCNTs易吸附平面结构的物质有关。C18对毒死蜱、乙螨唑、哒螨灵、咪鲜胺和唑虫酰胺等多种农药存在吸附现象，使其回收率显著低于净化前，可能由于C18本身极性较弱，对弱极性农药也具有一定吸附作用。因此，为了保证回收率并兼顾净化效果，最终选择将PSA作为吸附剂主体，并搭配少量GCB进一步去除色素类物质。

表1 24种农药的UPLC-MS/MS多反应监测参数

注：*为定量离子对

Note: * denotes quantitative ion pair

图2 正模式电喷雾串联质谱中水胺硫磷分子结构及碎片离子裂解途径

图3 使用不同盐析剂时茶叶中24种农药的回收率

对PSA用量进一步优化，比较了200、150、100 mg和50 mg PSA处理后的净化效果。如图5-A所示，不同PSA用量对大部分目标农药的回收率影响不显著，但多菌灵在50 mg和100 mg PSA处理下的回收率可达到70%以上。从基质效应看（图5-C），大部分农药的基质抑制效应随着用量的增加而明显改善。综合回收率和基质效应考虑，选择100 mg PSA为最终用量。

对GCB用量优化时，比较了100 mg PSA基础上分别加入50、25 mg和10 mg GCB处理后的净化效果。如图5-B所示，不同GCB用量对于大部分目标农药的回收率影响不大，但多菌灵的回收率随GCB用量增大而降低，在50 mg用量时降至60%以下。从基质效应看，随着GCB用量的增加，大部分农药的基质抑制未得到明显改善（图5-D），但对于色素类物质的去除效果提升。因此本研究最终选择100 mg PSA搭配25 mg GCB作为最终的吸附剂组合。

图5 PSA和GCB不同用量分散固相萃取净化处理下茶叶中24种农药的回收率和基质效应

2.2.3 涡旋时间的优化

本方法共有3次涡旋操作，第一次为提取步骤加入提取溶剂后；第二次为提取步骤加入盐析剂后；第三次为净化步骤提取液加至吸附剂后。本试验分别对3次涡旋时间进行了优化，提取阶段离心管中的2次涡旋时间均分别设置30 s、1 min、2 min和5 min进行比较，净化阶段注射器的涡旋时间设置30 s、1 min和2 min进行比较。结果如图6所示，第一、三次涡旋时间对目标农药回收率影响不显著。而随着第二次涡旋时间的延长，大部分农药的回收率略有上升，可能由于涡旋时间长对水分的去除更加充分。总体上，目标农药在第二次涡旋30 s后得到的回收率为61.0%～98.3%，可以满足检测需求，因此，3次涡旋均选择30 s作为涡旋时间以提高效率。

注：A：第一次涡旋B：第二次涡旋C：第三次涡旋

2.3 方法的准确度和精密度

在空白的红茶和绿茶样品中添加24种农药的混合标准溶液，开展添加回收试验，添加水平分别为0.01、0.05、0.5 mg·kg-1。回收率和相对标准偏差结果见表2。除了绿茶中烯啶虫胺在加标浓度为0.01 mg·kg-1时未能检出，其余目标农药在红茶和绿茶中的加标回收率范围在61.7%～98.8%，相对标准偏差（RSD，n=3）为0.1%～5.8%。结果表明，该方法准确度和精密度良好，符合多农残检测要求。

表2 红茶和绿茶样品中24种农药的平均回收率和相对标准偏差

续表2

2.4 方法的线性范围、检出限、定量限和基质效应

对1.3章节配制的系列混合标准工作液和基质混合（红茶、绿茶）标准工作液检测，绘制溶剂、红茶和绿茶的标准曲线。如表3所示，有23种农药的红茶（发酵茶）和绿茶（不发酵茶）基质标准工作液在不窄于1～100 μg·L-1的范围内线性关系良好，相关系数（2）均大于0.995。绿茶和红茶中23种农药的检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分别为0.05～3.70 μg·kg-1和0.18～12.35 μg·kg-1，表明本方法具有良好的灵敏度。烯啶虫胺在绿茶中灵敏度相对欠缺，检出限为5.36 μg·kg-1，定量限为17.86 μg·kg-1，在5～500 μg·L-1范围内线性关系良好（2=0.999 2）。

目标化合物的基质效应（ME值）计算公式如下：ME=基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率×100%。试验结果表明，24种农药在红茶和绿茶中的ME分别为20%～100%和11.1%～100%，总体上目标农药在绿茶中的基质抑制效应比红茶更强。噻虫胺、吡虫啉、噻虫嗪、灭多威等一些农药存在很强的基质抑制效应，其中噻虫胺、吡虫啉、噻虫嗪3个农药在绿茶中的ME均低于15%。为了校正基质效应，本方法使用基质空白液配制混合标准工作液。

2.5 实际样品分析与对比

采用建立的注射器结合UPLC-MS/MS法，对市售的红茶和绿茶共10份茶叶样品中的24种目标农药进行定性定量检测，并与实验室传统QuEChERS检测方法的结果进行比对。结果显示（表4），两种检测方法检出的农药品种相同，检出结果的相对偏差范围为2.2%～17.3%，表明本研究建立的新型检测方法与实验室传统方法结果具有一致性。

表3 红茶和绿茶中24种农药的线性方程、线性范围、相关系数、方法检出限及定量限

在样品前处理时间上，本研究建立的新型方法对单个样品净化时间可控制在2 min以内，而实验室传统方法由于需要较长时间的涡旋离心，通常单个样品的净化时间需要15 min左右。由此可见，本研究建立的新型检测方法可以在较短时间内完成茶叶中多种农药残留的提取净化过程，较传统方法在效率上有较大的提高。

表4 本研究方法与传统方法对10份茶样检出结果对比

3 讨论和结论

本研究通过对前处理条件、质谱条件等优化，建立了注射器内分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中24种农药残留的方法。该方法采用乙腈对茶叶样品提取，无水MgSO4盐析，在设计的注射器装置内以PSA和GCB组合净化，UPLC-MS/MS分析。通过对茶叶中24种农药平均回收率试验，显示该方法的平均回收率在61.7%～98.8%，RSD小于5.5%，说明该方法具有良好的准确度和精密度。通过对该方法的检出限试验，方法检出限在0.05～5.36 μg·kg-1，灵敏度良好。24种农药在线性范围内相关系数（2）均大于0.995，线性关系良好。与传统QuEChERS方法采用的dSPE相比，通过注射器装置简化了操作，可将单个样品的净化时间控制在2 min以内。方法具有操作简单易上手、所用仪器少、时间节省、普适性好等优点，适合用于茶叶中多农药残留的日常检测。

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Rapid Determination of 24 Pesticide Residues in Tea by in-Syringe Dispersive Solid Phase Extraction-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Jiali1,2,3,4, WANG Chen1,3,4*, CHEN Hongping1,3,4, CHAI Yunfeng1,3,4, ZHU Li1,3,4, LIU Xin1,3,4*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China; 3. Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 4. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Tea Products (Hangzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Based on the characteristics of tea matrix, a rapid pretreatment technology of in-syringe dispersive solid phase extraction (dSPE) was developed, and an analytical method based on ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established for the detection of 24 pesticide residues in tea. Tea samples were extracted using acetonitrile, salted-out with MgSO4, purified with primary secondary amine and graphitized carbon black as dispersive adsorbents in designed syringe devices, and detected by UPLC-MS/MS. Recoveries of 24 pesticides in black and green teas were 61.7%-98.8% at three spiked levels (0.01 mg·kg-1, 0.05 mg·kg-1and 0.5 mg·kg-1), which indicated high accuracy with the relative standard deviations of 0.4%-5.5%. The calibration curves of 24 pesticides in black and green teas showed good linearity with correlation coefficients (R2) higher than 0.995. The limits of detection (LOD) and the limits of quantitation (LOQ) were 0.05-5.36 μg·kg-1and 0.18-17.86 μg·kg-1, respectively, which show high sensitivity of this method. Being simple, fast, less instrument required and time-saving, this method is suitable for quantification of multiple pesticide residues in tea.

tea, ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, pesticide residues, in-syringe dispersive solid phase extraction

S571.1；TS207.3

A

1000-369X(2021)05-717-14

2021-02-01

2021-03-01

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-19）、中国农业科学院创新团队（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-06）、国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2020001）

马佳丽，女，硕士研究生，主要从事茶叶质量安全研究。*通信作者：wangchen@tricaas.com；liuxin@tricaas.com

（责任编辑：赵锋）