茶树WRKY转录因子CsWRKY17的克隆与表达分析

刘苗苗，臧连生，孙晓玲，周忠实，叶萌*

茶树WRKY转录因子的克隆与表达分析

刘苗苗1,2，臧连生1，孙晓玲2，周忠实3*，叶萌2*

1. 吉林农业大学生物防治研究所，吉林 长春 130118；2. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；3. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100094

WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在调节植物的抗虫防御反应中发挥关键作用。然而，目前抗虫相关WRKY转录因子的研究还主要集中于草本植物中，木本植物中的研究还十分滞后，仍有大量WRKY未被发掘与鉴定。以茶树龙井43为试验材料，克隆了1个WRKY转录因子基因，命名为。研究发现，全长序列为1 141 bp，包含1个987 bp的开放阅读框，编码328个氨基酸。结构域分析表明，基因具有1个典型的WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构，属于第Ⅱ亚家族。同源比对及系统发育树分析发现，CsWRKY17与拟南芥的AtWKRY11和AtWRKY17同源关系最近。此外，具有明显的组织表达特异性，并可被机械损伤、茶尺蠖取食或模拟取食、茉莉酸（JA）等外用激素处理诱导表达。亚细胞定位试验证实定位在细胞核中。综上结果表明，在细胞核中发挥功能，并很可能通过调节JA、脱落酸（ABA）、油菜素内酯（BR）和赤霉素（GA）等信号通路来调控茶树对植食性昆虫的诱导防御反应。研究结果为深入解析WRKY转录因子在茶树虫害相关信号通路中的作用打下基础，同时为茶树抗虫基因挖掘和抗虫品种选育提供了理论依据和参考。

茶树；WRKY转录因子；；表达分析；抗虫防御

植物在遭受植食性昆虫为害时，会迅速启动防御相关的信号通路，诱导抗性相关基因的表达，进而合成与防御相关的化合物以抵御虫害[1-4]。其中，转录因子（Transcription factors，TFs）在植物的抗虫防御信号调控中起着十分关键的作用[2,5-8]。转录因子又称为反式作用因子，是一类能够通过与靶基因（如抗虫化合物合成酶基因）启动子区域的顺式作用元件相结合，调控靶基因转录的DNA结合蛋白[9-10]。植物中含有很多转录调控因子家族，其中一些超家族拥有上百个成员基因，如MYB、WRKY、AP2/ERF、bHLH、bZIP、C2H2和NAC家族等[6,11-14]。WRKY TFs是植物中最大的转录因子家族之一，目前已在拟南芥（）中发现了超过70个WRKY成员，水稻（）中也发现了100多个WRKY成员[15-17]。

研究表明，WRKY TFs家族成员均含有一段约60个氨基酸组成的WRKY结构域，N末端含有WRKYGQK核心序列，具有高度保守性，其家族命名即来源于此；C端通常为C2H2或C2HC型锌指结构，主要介导WRKY TFs与目的DNA序列的特异性结合[16,18]。根据WRKY结构域的数量和锌指结构的类型，WRKY家族又被分为3个亚家族：第Ⅰ亚家族包含2个保守WRKY结构域和1个C2H2（Cx4-5Cx22-23HxH）型锌指结构；第Ⅱ亚家族包含1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构；第Ⅲ亚家族则包含1个WRKY结构域和1个C2HC（Cx7Cx23HxC）型锌指结构[17-18]。有报道表明，WRKY不仅可以结合目的基因启动子中的W-box（TTGACC/T）直接激活或者抑制防御信号通路相关基因的表达，还可以与其他WRKY相互作用来间接调节植物的免疫和防御[19-20]。

WRKY TFs在植物应对虫害胁迫过程中发挥关键作用。如Skibbe等[21]在野生烟草（）中鉴定到2个虫害响应基因和，单独或同时沉默和均提高了烟草对烟草天蛾（）的敏感性。Yao等[22]也在烟草中发现了3个受烟粉虱（）取食诱导的WRKY转录因子、和，沉默这3个基因会显著地增加烟粉虱的存活时间和产卵量。此外，水稻中的和均能正调控水稻体内胰蛋白酶抑制剂的含量，从而增强水稻对二化螟（）的抗性[23-24]。有意思的是，拟南芥中的受蚜虫取食为害诱导表达后，能有效降低桃蚜（）的取食难度，缩短其口针刺入维管束的时间，因而负调控植物的防御反应，使植物变得更易感蚜虫[25]。尽管WRKY在植物抗虫防御中的重要性已经被逐步证实，然而目前有关WRKY对植物抗虫防御调控作用的研究还主要集中在水稻、拟南芥、烟草等草本植物中，木本植物中抗虫相关的WRKY还鲜有报道。因此，挖掘和鉴定木本植物中的WRKY转录因子，对深入解析WRKY的抗虫调控机理、拓宽人们对植物-昆虫互作机制的理解具有重要意义。

茶树（）是一种重要的多年生木本经济作物，在其生长发育过程中常常受到多种害虫的为害，对茶叶的产量和品质造成巨大影响。因此，明确茶树虫害胁迫响应的分子调控机理、挖掘茶树抗虫相关基因，对今后选育茶树抗虫品种具有重要的指导价值。然而，茶树中有关WRKY TFs的研究还主要集中于其对低温、干旱、高盐等非生物胁迫的抗性调控方面[26-30]，目前仅通过克隆鉴定发现了基因可能参与了茶树抗虫防御反应[31]，还有大量虫害胁迫响应相关的WRKY TFs未被发掘和报道。基于此，本研究以龙井43为试验材料，克隆获得了1个新的茶树WRKY基因，并利用生物信息学分析了该基因的结构、理化特征以及进化关系等。此外，还进一步明确了该基因在细胞中发挥功能的位置，以及不同处理下的表达特征。本研究为深入解析WRKY在茶树虫害相关信号通路中的作用打下基础，同时为茶树抗虫基因的挖掘和抗虫品种的选育提供了理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以2年生龙井43盆栽苗为供试茶苗，预培养于中国农业科学院茶叶研究所玻璃温室大棚内。试验前挑选生长健壮、长势一致、无病虫害的茶苗转移至人工气候室[温度(26±2)℃，光周期L∶D=12∶12，相对湿度70%～80%]，恢复培养3～4 d后用于后续试验。

茶尺蠖（）幼虫采自中国农业科学院茶叶研究所试验茶园，于人工气候室内[温度(26±2)℃，光周期L∶D=14∶10，相对湿度65%～75%]用幼嫩的龙井43茶树叶片进行饲喂和种群繁殖。室内稳定驯养两代后，选取大小相近且健康活跃的二龄幼虫用于后续试验。

1.2 基因克隆

基于茶树转录组数据筛选出基因的转录本序列，经NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）确认其具有完整的开放阅读框。运用Primer Blast设计该基因全长特异性引物-F和-R（表1）。以茶尺蠖为害6 h后的茶树叶片cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD FX（TOYOBO）扩增全长片段，PCR反应总体系为20 μL，反应程序为68℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 90 s，35个循环；68℃延伸5 min。扩增所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后在紫外灯下切割，并使用胶回收试剂盒（Thermo GeneJET Gel Extraction Kit）对目的片段进行回收纯化，然后将其连入-Blunt Zero 载体（TRANSGEN BIOTECH）并转化至-T1感受态细胞中，用通用引物M13-F/R（表1）对阳性克隆进行PCR鉴定、保存，并送浙江尚亚生物科技有限公司测序。

表1 引物信息

1.3 生物信息学分析

运用在线软件ProtParam（http://web.expa sy.org/protparam）分析蛋白理化性质；运用Softberry（http://softberry.com）进行氨基酸序列分析；使用TBtools软件寻找目的基因在茶树染色体上的位置；在NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中下载其他同源蛋白序列，在MEGA 7.0软件中采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树（参数：poisson mode，complete delection，boostrap=1 000）；在DNAMAN中进行多序列比对；采用SWISS-MODEL软件预测蛋白三维结构，并用Pymol软件编辑输出。

1.4 茶苗处理

1.4.1 茶尺蠖幼虫取食（Eo）处理

选取大小一致的顶芽下第二叶位叶片，处理组接入10头二龄茶尺蠖幼虫，并用透明网袋罩住取食叶片防止幼虫逃逸；对照组用相同网袋罩住叶片。待害虫取食叶片有明显缺刻时开始计时，分别在处理1.5、3、6、12、24、36、48 h后剪取为害叶片，迅速浸入液氮中。设置6个生物学重复。

1.4.2 机械损伤（W）和机械损伤叠加茶尺蠖唾液（W+OS）处理

选取大小基本一致的顶芽下第二叶位叶片，用锯齿滚轮于主叶脉两侧各损伤2道（间距0.5 cm），并立即在损伤部位涂抹双蒸水（每片叶20 μL），作为W处理；在损伤部位涂抹茶尺蠖唾液（每片叶20 μL），作为W+OS处理；不做任何处理的茶树叶片作为对照。分别在处理1.5、3、6 h后剪取为害叶片，迅速浸入液氮中。设置6个生物学重复。

1.4.3 植物激素处理

茉莉酸（JA）处理：将适量JA溶解于少量无水乙醇中，然后用50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 8.0）配成浓度为150 μg·mL-1的溶液（含0.02%吐温20），每株茶苗喷施JA稀释液10 mL，以喷施10 mL磷酸缓冲液（含0.02%吐温20）的茶苗为对照。分别在处理0.5、1.5、3、6、12、24、48 h后剪取顶芽下第二叶位叶片，迅速浸入液氮中。设置6个生物学重复。

油菜素内酯（BR）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）、乙烯（ET）处理方法如下：用蒸馏水分别配置100 nmol·L-1BR、100 µmol·L-1ABA、10 µmol·L-1GA、100 µmol·L-1SA、200 mg·L-1ET的溶液，每株茶苗喷施处理液10 mL，以喷施10 mL蒸馏水（含0.02%吐温20）的茶苗为对照。处理24 h后剪取顶芽下第二叶位叶片，迅速浸入液氮中。设置6个生物学重复。

1.4.4 不同组织处理

选取生长状况相近的开花期茶树，分别取根、茎、叶、花等4个组织，剪取样品后迅速浸入液氮中。设置5个生物学重复。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

1.6 亚细胞定位

利用Exnase Ⅱ重组酶（Vazyme Biotech）将基因克隆至pBI121-GFP载体上，构建pBI121--GFP融合表达载体，随后转入DH5感受态细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定、保存，并送浙江尚亚生物科技有限公司测序。将测序正确的质粒转入农杆菌GV3101中，用含有卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）抗性的LB培养基进行筛选，并对阳性克隆进行PCR鉴定和保存。

取少量上述保存菌液接入5 mL含有Kan和Rif的LB液体培养基中，28℃，200 r·min-1活化，随后按1∶50稀释到诱导培养基（含Kan和Rif，10 mmol·L-1MES，20 µmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.6）中28℃、200 r·min-1培养过夜。收集菌液并弃去上清液，用浸润液（pH 5.7）重悬，将OD600调至1.0左右。室温静置3 h后，选取4～5叶期的本氏烟（），每株注射约1 mL菌液，3个生物学重复。室温正常条件下培养2 d后，在激光共聚焦显微镜下观察荧光情况。以pBI121-GFP空载体注射的本氏烟作为阳性对照。

1.7 数据统计与分析

根据试验设计和统计分析原理，利用SPSS 18.0（Chicago Illinois State USA）软件对试验数据进行统计分析。采用独立样本检验或方差分析（LSMeans进行多重比较）对的诱导表达水平进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 CsWRKY17的克隆与序列分析

以茶尺蠖为害6 h后的茶树叶片cDNA为模板，扩增获得长度约1 100 bp的特异性条带。对该条带进行纯化回收并连入-Blunt Zero载体后测序，得到的序列与转录组序列完全匹配。将测序结果在NCBI上进行Blastn分析，发现其与茶树基因组预测的（GeneBank: XM_028257290.1）序列相似度达99.91%。克隆获得的序列全长1 141 bp，包含987 bp开放阅读框，编码328个氨基酸残基，位于茶树第14条染色体上。

2.2 CsWRKY17的生物信息学分析

2.2.1 理化性质分析

利用ProtParam对CsWRKY17的理化性质进行分析，结果表明，CsWRKY17相对分子质量为35.7 kDa，理论等电点为9.66，共328个氨基酸，其中丝氨酸（Ser）含量最多，达到14.9%；包含26个负电荷残基[天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）]，42个正电荷残基[精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）]；不稳定系数为50.27，脂溶指数为62.44，总平均亲水性指数为–0.621，推测为不稳定亲水蛋白。

2.2.2结构域及三维结构分析

将CsWRKY17与拟南芥和水稻中WRKY蛋白进行同源性比对分析，结果显示，所有序列中均有一段高度保守的结构域，其N端含有1个典型的WRKYGQK核心序列，C端含有1个C2-H2型（Cx4-5Cx22-23HXH）锌指结构，表现为WRKY第Ⅱ亚家族的特征，说明CsWRKY17属于WRKYⅡ家族成员之一（图1）。进一步在SWISS-MODEL上对CsWRKY17蛋白的三维结构进行模拟分析，结果显示其WRKY结构域由5个反向平行的折叠和无规则卷曲组成，与已报道的茶树CsWRKY3、CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48等蛋白三维结构极其相似[27,31]，说明茶树WRKY家族结构域的高度保守性。

2.2.3系统发育树分析

为了分析茶树CsWRKY17与其他植物同源蛋白的进化关系，并由此推测其在茶树中可能发挥的功能，本研究在拟南芥（）、水稻（）小麦（）、棉花（）、大豆（）等代表物种中选取了15个同为WRKY第Ⅱ亚家族、与CsWRKY17同源性较高且已知生物学功能的蛋白序列，利用MEGA 7.0软件，采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）进行进化分析，构建系统发育树。聚类结果显示，茶树CsWRKY17与拟南芥AtWRKY17和AtWRKY11聚到一起，亲缘关系最近，而与OsWRKY11、GhWRKY48亲缘关系较远（图2）。

图1 茶树CsWRKY17蛋白同源比对

注：拟南芥：AtWRKY7（AT4G24240.1）、AtWRKY11（AT4G31550.1）、AtWRKY17（AT2G24570.1）、AtWRKY15（AT2G23320.1）、AtWRKY74（AT5G28650.1）、AtWRKY39（AT3G04670.1）、AtWRKY6（AT1G62300.1）；水稻：OsWRKY51（LOC_Os04g21950.1）、OsWRKY68（LOC_Os04g51560.1）、OsWRKY25（LOC_Os08g13840.2）、OsWRKY11（LOC_Os01g43650.1）；小麦：TaWRKY53（ALC04270.1）；大豆：GmWRKY13（NP_001237376.2）；棉花：GhWRKY17（ADW82098.1）、GhWRKY39（AGX27510.1）、GhWRKY48（AFB35811.1）

2.3 CsWRKY17表达模式分析

2.3.1的组织表达特异性分析

为明确的表达模式，首先检测了茶树不同组织器官中的转录水平。结果发现，在茶树的根、茎、叶、花等组织器官中均有表达，且具有明显的组织特异性（图3）。以茶树叶中的表达量为参照进行分析，发现茶树茎中的表达量仅为叶中的43%，差异显著；而花中的表达量与叶中相当；在根部的表达量显著高于其他组织部位，约为叶的4.75倍（图3）。上述结果表明，在茶树根部表达量最高，其次为叶和花，在茎中表达量最低。

2.3.2对虫害胁迫的响应分析

为探究是否参与茶树对虫害胁迫的响应，对该基因在虫害胁迫下的表达谱进行分析。结果表明，与对照相比，茶尺蠖幼虫取食显著上调的表达量，且在取食1.5 h后即可诱导，并随取食时间的增加，诱导倍数也呈现增长趋势，到36 h和48 h时达到顶峰，诱导倍数为7.66～7.10倍（图4-A）。由于茶尺蠖幼虫取食过程中伴随着机械损伤和口腔分泌物的双重作用，为厘清基因究竟受哪一种作用影响，利用机械损伤叠加茶尺蠖唾液的方式（W+OS）模拟害虫取食处理茶苗，同时设置机械损伤（W）处理和未处理茶苗（Control）两个对照。结果显示，在1.5 h时间点上单独W处理即能显著诱导的表达，而W+OS处理与W处理相比诱导更为强烈，且持续时间更长，处理3 h后表达水平在W处理中已不再上调，而在W+OS处理中依然显著上调（图4-B）。上述结果表明，对虫害的诱导响应是机械损伤和唾液的共同作用，且唾液起主导作用，推测可能参与了茶树对茶尺蠖的抗性反应。

注：图中不同的小写字母表示各个处理之间方差分析存在显著差异（P<0.05）

注：A为茶尺蠖幼虫取食处理；B为茶尺蠖模拟取食处理。*表示处理与对照相比存在显著差异（*，P<0.05；**，P<0.01；Student's t-tests）。不同的小写字母表示各个处理之间方差分析存在显著差异（P<0.05）。下同

2.3.3对多种激素的响应分析

为进一步探究可能介导的防御信号通路，利用qRT-PCR分析了对JA、SA、ET、BR、ABA、GA等防御相关信号分子的响应情况。由于茶尺蠖幼虫取食能够显著激活，因此对与咀嚼式口器昆虫抗性相关的JA处理进行了不同时间点的详细分析。试验结果表明，JA、ABA、BR和GA处理均能显著上调的表达（图5-A和5-B），其中JA处理12 h后即可显著上调该基因表达量，并持续至处理后48 h（图5-A）；而对SA和ET处理则无明显响应（图5-C），由此推测可能参与了JA、ABA、BR和GA相关信号的作用网络。

2.4 CsWRKY17的亚细胞定位分析

为明确CsWRKY17在细胞中可能发挥功能的位置，通过构建pBI121--GFP融合表达载体，运用农杆菌侵染法浸润核定位的转基因本氏烟叶片，使目的基因在烟草叶片中进行瞬时表达，以pBI121-GFP空载体作为阳性对照。试验结果如图6所示，空载体在全细胞中均能观察到绿色荧光，而融合了后仅在细胞核中观察到绿色荧光信号，且与核定位的转基因烟草中的红色荧光信号重叠，呈现黄绿色荧光，说明很可能在细胞核中行使其生物学功能。

3 讨论

WRKY TFs在调节虫害诱导的防御反应中发挥重要作用，然而茶树中参与抗虫胁迫的WRKY却鲜有报道。本研究克隆获得了1个WRKY基因。同源性比对和结构域分析表明，含有1个典型WRKY结构域和1个C2H2型（C-X4-C-X23-HX-H）锌指结构，属于第Ⅱ亚家族；聚类分析结果表明，CsWRKY17与AtWRKY11和AtWRKY17聚为同一个分支，关系最近。Journot-Catalino等[32]研究发现，AtWRKY11和AtWRKY17参与调节拟南芥中生物和非生物胁迫相关防御过程，单独敲除或同时敲除和会显著增强拟南芥对病原菌pv的基础抗性。Ali等[33-34]研究表明，和不仅可以正调控拟南芥对胞囊线虫（）的抗性，还可以正调控拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受力。据此，我们推测很可能也在茶树应对生物或非生物胁迫反应中发挥重要功能。

注：A为茉莉酸处理；B为油菜素内酯、脱落酸和赤霉素处理；C为水杨酸和乙烯处理。BUF表示缓冲液处理

注：将CsWRKY17克隆到pBI121-GFP载体中，空载体作为阳性对照。GFP：绿色荧光蛋白；RFP：红色荧光蛋白

本研究表明，茶尺蠖取食后，的表达量从虫害诱导的早期（1.5 h）被显著诱导并持续到48 h。同样地，在受到烟草天蛾幼虫取食时，烟草中的和会迅速上调（15 min左右）[21]；二化螟取食30 min后即会诱导水稻的表达[24]。另外，本研究发现，尽管机械损伤也能诱导的表达，但却明显低于茶尺蠖唾液处理。机械损伤和茶尺蠖取食亦能显著诱导茶树中虫害胁迫相关的[31]。因此，我们推测参与了茶树抗虫反应，并且是茶树虫害诱导防御反应早期的调节子。

本研究发现，JA处理12 h后以及BR、ABA、GA处理24 h后均诱导的表达。在水稻中，JA处理显著诱导的表达，诱导表达后的会抑制水稻体内JA的含量，从而控制和平衡水稻对二化螟的防御反应[23]。在棉花中，ABA能够显著诱导的表达水平，通过激活ABA信号通路相关基因的表达来增强植物对干旱胁迫的耐受性[35]。同样地，拟南芥中的WRKY46、WRKY54和WRKY70为BR信号通路的正调节子，BR处理强烈促进这3个基因的表达[36]。当、、同时突变后，BR对拟南芥的生长调控作用消失[36]。有意思的是，GA处理抑制了卷心菜（var.）中的表达，而能够与GA合成相关基因以及启动子中的W-box相结合，从而抑制这2个基因的表达[37]。以上研究均暗示了很可能也是通过调节JA、BR、ABA或GA信号通路来调控茶树对茶尺蠖的防御和抗性。

在茶树根、茎、叶和花中均有表达。其中，根中的表达量最高，叶片和花中次之。前人研究显示，WRKY基因的表达具有组织特异性，例如：抗性基因主要在番茄的根部表达[38]，主要表达于水稻的节间和花穗中[39]。在根中的组成型高表达以及在叶中受茶尺蠖取食后的诱导表达，暗示了其可能不仅参与调节茶树叶片对虫害的抗性，还可能参与调节根对非生物或生物胁迫的响应。

大量研究表明，WRKY TFs能在细胞核中与靶基因的启动子相结合，进而调控靶基因的表达。如在细胞核中与SA相关基因、JA相关基因和的启动子相结合，调控水稻中JA和SA的相关信号通路以及植株体内SA的含量[40]。也定位于细胞核中，它不仅可以直接结合GA信号通路关键基因的启动子W1、W2和W3区域以增强的表达水平，还能够与SLR1蛋白相互作用来增加它的稳定性，从而抑制水稻体内的GA信号通路[39]。本研究的亚细胞定位试验发现定位于细胞核中，并受到JA、BR、ABA、GA等外源激素处理的诱导表达。因此我们推测，也很可能在细胞核中与靶基因的启动子相结合，进而调控JA、BR、ABA和GA信号通路相关基因的表达，但具体的互作靶标和调控机制还有待进一步研究。

本研究从茶树中克隆得到转录因子，并详细分析了其物理和化学特征，探究了在机械损伤、茶尺蠖为害和不同激素处理下的表达模式，以及在不同组织器官中的表达差异性，同时明确了该基因在细胞中发挥生物学功能的位置，推测CsWRKY17是虫害诱导防御反应的一个早期调节子，并很可能通过参与调节JA、BR、ABA和GA等信号通路来调控茶树对茶尺蠖的抗性反应。本研究不仅为深入解析WRKY调节植物抗虫防御反应的作用机制打下了基础，还为茶树抗虫新基因的挖掘和茶树抗虫品种的遗传改良提供重要参考和依据。

[1] Erb M, Kliebenstein D J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: the blurred functional trichotomy [J]. Plant Physiology, 2020, 184(1): 39-52.

[2] Erb M, Reymond P. Molecular interactions between plants and insect herbivores [J]. Annual Review of Plant Biology, 2019, 70: 527-557.

[3] Aerts N, Mendes M P, Van Wees S C M. Multiple levels of crosstalk in hormone networks regulating plant defense [J]. The Plant Journal, 2021, 105(2): 489-504.

[4] Wang J, Wu D, Wang Y, et al. Jasmonate action in plant defense against insects [J]. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(13): 3391-3400.

[5] Ng D W, Abeysinghe J K, Kamali M. Regulating the regulators: the control of transcription factors in plant defense signaling [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(12): 3737. doi: 10.3390/ijms19123737.

[6] Cao Y P, Li K, Li Y L, et al. MYB transcription factors as regulators of secondary metabolism in plants [J]. Biology, 2020, 9(3): 61. doi: 10.3390/biology9030061.

[7] 吴雨捷, 吴健, 王幼平, 等. WRKY转录因子在植物抗逆反应中的功能研究进展[J]. 分子植物育种, 2020, 18(22): 7413-7422.

Wu Y J, Wu J, Wang Y P, et al. Advances in the function of WRKY transcription factor in plant stress response [J]. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(22): 7413-7422.

[8] He J, Bouwmeester H J, Dicke M, et al. Genome-wide analysis reveals transcription factors regulated by spider-mite feeding in cucumber () [J]. Plants, 2020, 9(8): 1014. doi: 10.3390/plants9081014.

[9] Rushton P J, Torres J T, Parniske M, et al. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes [J]. EMBO Journal, 1996, 15(20): 5690-5700.

[10] Ciolkowski I, Wanke D, Birkenbihl R P, et al. Studies on DNA-binding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function [J]. Plant Molecular Biology, 2008, 68(1/2): 81-92.

[11] Bian Z Y, Gao H H, Wang C Y. NAC transcription factors as positive or negative regulators during ongoing battle between pathogens and our food crops [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 22(1): 81. doi: 10.3390/ijms22010081.

[12] Feng K, Hou X L, Xing G M, et al. Advances in AP2/ERF super-family transcription factors in plant [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2020, 40(6): 750-776.

[13] Kielbowicz-Matuk A. Involvement of plant C2H2-type zinc finger transcription factors in stress responses [J]. Plant Science, 2012, 185/186: 78-85.

[14] Alves M S, Dadalto S P, Goncalves A B, et al. Plant bZIP transcription factors responsive to pathogens: a review [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(4): 7815-7828.

[15] Bakshi M, Oelmüller R. WRKY transcription factors [J]. Plant Signaling & Behavior, 2014, 9: e27700. doi: doi.org/10.4161/psb.27700.

[16] Rushton P J, Somssich I E, Ringler P, et al. WRKY transcription factors [J]. Trends in Plant Science, 2010, 15(5): 247-258.

[17] Chen F, Hu Y, Vannozzi A, et al. The WRKY transcription factor family in model plants and crops [J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 2017, 36(5/6): 311-335.

[18] Eulgem T, Rushton P J, Robatzek S, et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors [J]. Trends in Plant Science, 2000, 5(5): 199-206.

[19] Jiang J, Ma S, Ye N, et al. WRKY transcription factors in plant responses to stresses [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2017, 59(2): 86-101.

[20] Bai Y L, Sunarti S, Kissoudis C, et al. The role of tomatogenes in plant responses to combined abiotic and biotic stresses [J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 801. doi: 10.3389/fpls.2018.00801.

[21] Skibbe M, Qu N, Galis I, et al. Induced plant defenses in the natural environment:WRKY3 and WRKY6 coordinate responses to herbivory [J]. Plant Cell, 2008, 20(7): 1984-2000.

[22] Yao D M, Zou C, Shu Y N, et al. WRKY transcription factors inmodulate plant immunity against whitefly via interacting with MAPK cascade pathways [J]. Insects, 2020, 12(1): 16. doi: 10.3390/insects12010016.

[23] Hu L F, Ye M, Li R, et al. The rice transcription factor WRKY53 suppresses herbivore-induced defenses by acting as a negative feedback modulator of mitogen-activated protein kinase activity [J]. Plant Physiology, 2015, 169(4): 2907-2921.

[24] Li R, Zhang J, Li J, et al. Prioritizing plant defence over growth through WRKY regulation facilitates infestation by non-target herbivores [J]. Elife, 2015, 4: e04805. doi: 10.7554/elife.04805.

[25] Kloth K J, Wiegers G L, Busscher-Lange J, et al. AtWRKY22 promotes susceptibility to aphids and modulates salicylic acid and jasmonic acid signalling [J]. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(11): 3383-3396.

[26] 郭俊红, 王伟东, 谷星, 等. 茶树WRKY转录因子基因的克隆及表达分析[J]. 茶叶科学, 2017, 37(4): 411-419.

Guo J H, Wang W D, Gu X, et al. Cloning and expression analysis of WRKY transcription factor genetranscription factor in tea plants () [J]. Journal of Tea Science, 2017, 37(4): 411-419.

[27] 王鹏杰, 岳川, 陈笛, 等. 茶树、和基因的分离及表达分析[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2019, 45(1): 30-38.

Wang P J, Yue C, Chen D, et al. Isolation and expression analysis of,andgenes in tea plant [J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences), 2019, 45(1): 30-38.

[28] 王鹏杰, 陈笛, 林浥, 等. 8个茶树WRKY转录因子基因的克隆与表达分析[J]. 中草药, 2019, 50(3): 685-693.

Wang P J, Chen D, Lin Y, et al. Cloning and expression analysis of eight WRKY genes in[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(3): 685-693.

[29] 肖罗丹, 唐磊, 王伟东, 等. 茶树转录因子的克隆及功能分析[J]. 中国农业科学, 2020, 53(12): 2460-2476.

Xiao L D, Tang L, Wang W D, et al. Cloning and functional analysis oftranscription factors in tea plant [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(12): 2460-2476.

[30] Wang Y, Shu Z, Wang W, et al., a novelgene from, is involved in cold and drought stress responses [J]. Biologia Plantarum, 2016, 60: 443-451.

[31] 戈林刚, 叶保华, 辛肇军, 等. 茶树基因的克隆及表达分析[J]. 山东农业科学, 2018, 50(1): 1-8.

Ge L G, Ye B H, Xin Z J, et al. Cloning and expression analysis ofgene in[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2018, 50(1): 1-8.

[32] Journot-Catalino N, Somssich I E, Roby D, et al. The transcription factors WRKY11 and WRKY17 act as negative regulators of basal resistance in[J]. Plant Cell, 2006, 18(11): 3289-3302.

[33] Ali M A, Wieczorek K, Kreil D P, et al. The beet cyst nematodemodulates the expression of WRKY transcription factors in syncytia to favour its development in Arabidopsis roots [J]. PLoS One, 2014, 9(7): e102360. doi: 10.1371/journal.pone.0102360.

[34] Ali M A, Azeem F, Nawaz M A, et al. Transcription factors WRKY11 and WRKY17 are involved in abiotic stress responses in[J]. Journal of Plant Physiology, 2018, 226: 12-21.

[35] Ullah A, Sun H, Hakim, et al. A novel cotton WRKY gene,-like, improves salt tolerance by activating the ABA signaling pathway and scavenging of reactive oxygen species [J]. Physiologia Plantarum, 2018, 162(4): 439-454.

[36] Chen J, Nolan T M, Ye H, et al. Arabidopsis WRKY46, WRKY54, and WRKY70 transcription factors are involved in brassinosteroid-regulated plant growth and drought responses [J]. Plant Cell, 2017, 29(6): 1425-1439.

[37] Fan Z Q, Tan X L, Shan W, et al. Characterization of a transcriptional regulator, BrWRKY6, associated with gibberellin-suppressed leaf senescence of Chinese flowering cabbage [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(8): 1791-1799.

[38] Singh D, Debnath P, Roohi, et al. Expression of the tomato WRKY gene,, alters root sensitivity to ethylene, auxin and JA and affects aerial architecture in transgenic Arabidopsis [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants, 2020, 26(6): 1187-1199.

[39] Lan J, Lin Q, Zhou C, et al. Small grain and semi-dwarf 3, a WRKY transcription factor, negatively regulates plant height and grain size by stabilizing SLR1 expression in rice [J]. Plant Molecular Biology, 2020, 104(4/5): 429-450.

[40] Qiu D Y, Xiao J, Ding X H, et al. OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate- and jasmonate-dependent signaling [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2007, 20(5): 492-499.

Cloning and Expression Analysis ofTranscription Factor in Tea Plants

LIU Miaomiao1,2, ZANG Liansheng1, SUN Xiaoling2, ZHOU Zhongshi3*, YE Meng2*

1. Institute of Biological Control, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094, China

WRKY transcription factors, a super family of plant transcription factors, play an essential role in the regulation of plant defense responses to herbivores. While the roles of herbivore-related WRKY transcription factors are well established in grass plants, their roles in woody plants are still largely unknown. Here, we cloned a WRKY transcription factor, named.has a full length of 1 141 bp, contains a 987 bp open reading frame, and encodes 328 amino acids. Based on the conserved domain analysis,belongs to the WRKY Ⅱ subfamily, containing one conserved WRKY domain and a typical C2H2-type zinc finger motif. Homology alignment and phylogenetic tree analysis show that CsWRKY17 has the closest relationship with AtWKRY11 and AtWRKY17 in. Moreover,exhibited a tissue specific expression, and was also induced by mechanical wounding, tea geometrid () attack, simulated herbivory, and exogenous phytohormone treatments like JA. Transient expression experiments indicate that it might play a role in the nucleus. Taken together, we proposed thatis a potential regulator of herbivore-induced defense responses against herbivores in tea plants through JA, ABA, GA and BR signaling. Our study paved the way for molecular analysis of herbivore-relatedWRKY genes in tea plants, and provided a good genetic resource and theoretical basis for future studies of pest-resistant genes and breeding of tea plants.

, WRKY transcription factors,, expression analysis, herbivore resistance

S571.1；Q52

A

1000-369X(2021)05-631-12

2021-04-30

2021-06-03

国家自然科学基金（31901898）、中央级公益性科研院所基本科研业务费（1610212019001）

刘苗苗，女，硕士研究生，主要从事植物与昆虫互作研究。*通信作者：zs.zh@126.com；mengye@tricaas.com

（责任编辑：黄晨）