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茯砖茶对葡聚糖硫酸钠诱导UC小鼠炎症及肠道微生物的影响

2021-10-16黄翔翔谭婷禹利君王坤波黄建安徐诗钰刘仲华

茶叶科学 2021年5期
关键词:砖茶条带结肠

黄翔翔,谭婷,禹利君,2,3*,王坤波,2,3,黄建安,2,3,徐诗钰,刘仲华,2,3*

茯砖茶对葡聚糖硫酸钠诱导UC小鼠炎症及肠道微生物的影响

黄翔翔1,谭婷1,禹利君1,2,3*,王坤波1,2,3,黄建安1,2,3,徐诗钰1,刘仲华1,2,3*

1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室,湖南 长沙 410128;2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南 长沙 410128;3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南 长沙 410128

为研究茯砖茶对葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)小鼠的抗炎作用及肠道微生物多样性的影响,将60只C57BL/6雌性小鼠随机分成正常对照组、10 mg·kg-1EGCG对照组、高剂量茯砖茶(300 mg·kg-1)对照组、DSS模型组、DSS+10 mg·kg-1EGCG处理组、DSS+低剂量茯砖茶(100 mg·kg-1)处理组、DSS+中剂量茯砖茶(150 mg·kg-1)处理组、DSS+高剂量茯砖茶(300 mg·kg-1)处理组,对照组n=5,处理组n=9。DSS造模1周后,灌喂处理4周,试验5周后处死小鼠,观察小鼠结肠组织病理学变化,评估小鼠结肠炎疾病指数(Disease activity index,DAI),检测小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子水平及小鼠结肠组织中、基因表达水平,利用PCR-DGGE、克隆测序等技术分析小鼠肠道微生物菌群多样性。结果表明,与DSS模型组相比,灌喂EGCG和不同剂量茯砖茶后,小鼠生存质量、结肠组织形态明显改善,显著降低了小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-水平(<0.05);显著降低、基因表达(<0.05),抑制了/炎性信号通路;肠道微生物多样性增加、丰富度提高,不同处理组优势菌群发生变化。综上所述,茯砖茶可通过抑制/炎性信号通路以及调节小鼠肠道微生物多样性来改善DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎。

茯砖茶;溃疡性结肠炎;炎性指标;肠道微生物多样性;变性梯度凝胶电泳

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)的一种,具有反复发作性、无确切病因、根治困难等特点,其发病率呈逐年增长趋势,被世界卫生组织列为难治病症之一。当前研究认为,宿主异常免疫应答、炎症反应和肠道微生物菌群失调是导致UC发病的重要原因[1-2]。易感基因、环境因素与免疫系统之间复杂的交互作用,导致炎性细胞浸润、炎性因子产生,使肠黏膜组织发生炎症反应[3]。/信号通路与炎症反应密切相关,它的激活促进了炎症反应产生,加重如UC等炎症性疾病的发生[4]。UC患者体内肠道菌群组成与正常人相比有较大改变,肠道菌群的物种丰富性、多样性和稳定性降低,肠道黏液层结构被破坏,肠道菌群生态处于失衡、紊乱状态[5-6]。肠道中细菌种类变化与肠道疾病活动密切相关、如IBD患者肠道中部分肠杆菌科()细菌、瘤胃球菌()和脱硫弧菌()等致病菌数量增加,而柔嫩梭菌群()、毛螺菌科()菌群等益生菌减少[7-8]。UC患者粪便中微生物菌群组成可作为UC病情的生物标志物,监控疾病活动程度和治疗效果[9-10]。利用膳食、天然产物、益生菌等疗法减轻炎症反应,修复IBD患者体内肠道菌群,是治疗和缓解UC病症的新策略[11-13]。

茯砖茶是我国特有的黑茶,黑毛茶先汽蒸压砖、再经冠突散囊菌“发花”而来,不仅拥有茶多酚、茶色素和茶多糖等茶叶本身的有效活性物质,还因冠突散囊菌参与茶叶的代谢转化,具有抗炎[14]、降脂[15]、调节肠胃[16]等特殊功效。长期以黑茶进行膳食补充可以增强人体免疫力、调节人体肠道菌群[17],茯砖茶提取物可提高小鼠体内抗氧化酶活性,降低炎性因子表达水平,对葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC具有改善作用[18]。茶多酚可有效提高细胞抗氧化水平,改善结肠组织损伤,降低结肠炎病症程度;影响宿主对糖类的吸收与利用,调节宿主肠道细菌菌群[19-21]。但茯砖茶对DSS诱导的UC小鼠模型/炎性代谢通路和肠道菌群的影响未见研究报道。本研究以DSS建立UC小鼠模型,通过对小鼠血清炎性因子水平、结肠组织中炎性代谢通路、基因表达情况、不同处理时期小鼠粪便中肠道细菌菌群变化进行分析,评估EGCG和不同剂量茯砖茶对UC小鼠的改善作用,以期从/炎性通路和肠道微生物组成角度探索茯砖茶对UC的预防及治疗作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

茯砖茶由湖南省白沙溪茶厂股份有限公司提供;EGCG(纯度≥98%)由湖南农业大学茶学教育部重点实验室提供;DSS购于美国MP Biomedicals公司;小鼠肿瘤坏死因子(TNF-)、干扰素(IFN-)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素1(IL-1)酶联免疫分析试剂盒购于北京诚林生物科技有限公司;实时荧光定量PCR试剂盒SYBR premix EX TaqTM、逆转录试剂盒PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser购于日本Takara公司;粪便基因组试剂盒、pGM-T连接试剂盒、大肠杆菌DH5感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司;、、基因和16 S rDNA V3区通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 仪器设备

旋转浓缩蒸发仪(Buchi,瑞士),冷冻干燥机(Buchi,瑞士),梯度PCR仪(Applied Biosystems,美国),实时荧光定量PCR仪(Roter-Gene Q,美国),DGGE变性凝胶电泳仪(Bio-Rad,DCodeTM,美国),Gel DocTM凝胶成像仪(Bio-Rad,美国)等。

1.3 茯砖茶提取物的制备

粉碎茯砖茶砖,收集12目筛底茶样,称取50 g茯砖茶粉于1 L锥形瓶中,重复取样4次,按1∶15(∶)茶水比,于100℃沸水浴浸提30 min,抽滤合并滤液,旋转减压蒸发浓缩至呈粘稠状,真空冷冻干燥24 h,获得茯砖茶水提取物冻干粉,–80℃密封保存、备用。

1.4 动物实验

C57BL/6雌鼠60只,(SPF级,体质量18~20 g、4周龄),购自长沙斯莱克景达实验动物有限公司,生产许可证号:CXK(湘)2016-0002。动物实验经湖南农业大学动物实验委员会批准,饲养于湖南农业大学茶叶研究所动物实验中心。动物房温度(25±1)℃,湿度40%~70%,光照时间12 h昼夜交替,自由供给饮用水和基础饲料,饲料主要营养成分:粗蛋白24.3%、粗灰粉8.6%、粗脂肪7.5%、粗纤维3.5%、钙1.2%、磷0.7%,含水量7.5%。小鼠适应性喂养1周,以体重权重为基础,随机分为正常对照组(Control)、10 mg·kg-1EGCG对照组(EGCG control)、高剂量茯砖茶对照组(HBT control,300 mg·kg-1)、DSS模型处理组(DSS)、DSS+10 mg·kg-1EGCG处理组(DSS+EGCG)、DSS+低剂量茯砖茶处理组(DSS+LBT,100 mg·kg-1)、DSS+中剂量茯砖茶处理组(DSS+MBT,150 mg·kg-1)、DSS+高剂量茯砖茶处理组(DSS+HBT,300 mg·kg-1),对照组每组5只小鼠(n=5),处理组每组9只小鼠(n=9)。所有小鼠接受5周试验。试验第1周,对照组小鼠全部自由饮用无菌水,处理组小鼠全部自由饮用含3% DSS的无菌水,以此建立UC小鼠模型。从第2周开始,正常对照组及DSS模型组小鼠每天灌喂生理盐水;EGCG对照组和DSS+EGCG组每天灌喂剂量为10 mg·kg-1的EGCG;HBT、DSS+LBT、DSS+MBT、DSS+HBT组小鼠每天分别灌喂剂量为300、100、150、300 mg·kg-1的茯砖茶水提取物,给茶处理4周。试验过程中每7 d对小鼠进行腹部按摩刺激收集新鲜小鼠粪便于无菌EP管中,存于–20℃冰箱备用。第5周结束后,摘小鼠眼球取血,收集小鼠结肠组织备用。

1.5 小鼠体征指标观察

每组小鼠每日添加约50 g饲料,观察小鼠进食、活动、毛发等生存状态,记录小鼠体重变化,观察小鼠粪便性状及粪便隐血、出血情况,评估结肠炎疾病指数(Disease activity index,DAI)。DAI评定标准见表1,DAI评分=体重下降评分+大便性状评分+大便隐血评分[22]。

1.6 小鼠结肠病理组织切片分析

取1~2 cm洗净后的结肠组织用10%福尔马林浸泡24 h,苏木精-伊红染色法(HE)染色,于光学显微镜下观察结肠病理组织学变化。

1.7 血清炎性因子检测

小鼠眼球血收集于2 mL离心管中,4℃冰箱静置1 h后,3 000 r·min-1离心20 min,收集上清液,按照酶联免疫分析试剂盒说明书操作,检测IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子表达量。

1.8 结肠组织JAK2、STAT3基因表达分析

1.9 PCR-DGGE分析

1.9.1 小鼠粪便总DNA提取

按照TIANamp Stool DNA Kit的操作步骤对每周收集的小鼠粪便进行细菌总DNA提取,提取后的DNA于–20℃冰箱中保存备用。

1.9.2 细菌16 S rRNA基因扩增

用带有GC夹的特异性引物(表3)对细菌16 S rRNA基因V3可变区进行扩增。PCR反应体系为25 μL:10×Tap mix buffer 2.5 μL,上、下游引物各1 μL,dNTP 2 μL,Taq酶0.25 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 16.25 μL。PCR反应程序为:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸7 min后放至4℃冰箱保存。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 DSS诱导小鼠结肠炎疾病活动指数评分标准(DAI)

表2 JAK2、STAT3、GAPDH引物序列

表3 小鼠肠道菌群V3区通用引物序列

1.9.3 DGGE电泳

通过美国Bio-Rad公司DcodeTM突变检测系统进行变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)。使用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,凝胶浓度线性梯度为35%~65%(100%变性剂对应7 mol·L-1尿素和40%去离子甲酰胺),电泳温度60℃,电压100 V,电泳时间10 h,电泳完毕后对DGGE凝胶进行漂洗,溴化乙锭染色20 min,最后使用紫外光成像系统进行成像、拍照观察。

1.9.4 特异条带切胶回收与克隆测序

根据DGGE条带图谱,切取特异性凝胶条带置于2 mL无菌EP管中,加入500 μL超纯水冲洗3次,再加添加50 μL超纯水,4℃冰箱中过夜保存。12 h后取出样品,在4℃下3 000 r·min-1离心10 min,取10 μL上清液进行PCR特异性扩增,此次使用的上游引物不带GC夹。扩增后的产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳验证条带大小及质量。将扩增的特异性条带切胶回收、纯化,按照pGM-T连接试剂盒说明书进行肠道微生物的T载体连接,转化至DH5感受态细胞,经蓝白斑筛选、PCR检测后,筛选阳性克隆,委托深圳华大基因科技服务有限公司进行序列测定。

1.10 统计分析

2 结果与分析

2.1 茯砖茶对小鼠体征指标的影响

正常对照组、EGCG对照组和HBT对照组小鼠在整个试验期间精神状态和饮食良好,毛发乌黑有光泽,粪便状态正常、呈颗粒状,体重平稳增长。DSS模型组、DSS+EGCG组、DSS+LBT组、DSS+MBT组和DSS+HBT组小鼠在DSS造模后,掉毛严重,精神萎靡不振、惊恐,大便血红色、稀便,肛门有血迹,相对体重显著降低(<0.05);经4周EGCG和不同剂量茯砖茶灌喂处理后,小鼠相对体重均增加,达到处理开始水平,茯砖茶对UC小鼠相对体重的影响如图1-A所示。

不同剂量茯砖茶对UC小鼠DAI的影响如图1-B所示。正常对照组、EGCG对照组和HBT对照组小鼠DAI无显著差异,说明EGCG和茯砖茶对正常小鼠DAI没有影响。经EGCG和不同剂量茯砖茶灌喂后,与DSS模型组相比,DSS+EGCG组、DSS+LBT组、DSS+MBT组和DSS+HBT组小鼠DAI降低,最终接近正常对照组;其中,DSS+MBT处理组小鼠灌喂茯砖茶1周后,DAI显著降低(<0.05),说明150 mg·kg-1剂量的茯砖茶对急性UC损伤有显著的改善作用。

2.2 小鼠结肠病理组织分析

10 mg·kg-1EGCG和不同剂量茯砖茶对DSS诱导的UC小鼠结肠组织炎症有不同的改善作用。由图2可知,正常对照组小鼠的结肠上皮结构完整,肠腺在黏膜肌层上部排列整齐;EGCG对照组和HBT对照组基本接近正常组;与正常对照组相比,DSS模型组小鼠结肠组织上皮不完整,上皮细胞脱落,杯状细胞减少,肠腺损伤,在肌层和黏膜下层出现炎性细胞浸润。DSS+EGCG处理组和DSS+MBT处理组的小鼠结肠组织最接近于正常对照组,说明EGCG和茯砖茶对DSS诱导的UC小鼠结肠组织炎症有一定改善作用。

图2 茯砖茶对UC小鼠结肠病理组织切片的影响

2.3 茯砖茶对UC小鼠血清炎性因子的影响

IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子与肠道疾病的发生和发展相关。茯砖茶对UC小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-含量的影响如图3所示,与正常对照组相比,DSS模型组小鼠血清中TNF-、IL-6、IL-8、IL-1和IFN-含量(<0.01)极显著上升。与DSS模型组相比,DSS+EGCG处理组小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-和IFN-含量极显著下降(<0.01);DSS+LBT组小鼠血清中IFN-和IL-1含量极显著降低(<0.01);DSS+MBT组和DSS+HBT组小鼠血清中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-、IFN-含量极显著降低(<0.01),说明EGCG及茯砖茶对UC小鼠的炎症反应有改善作用。

2.4 茯砖茶对UC小鼠结肠组织JAK2、STAT3基因相对表达量的影响

/信号通路和炎症反应密切相关,它的激活促进了UC发展。茯砖茶对UC小鼠中、基因mRNA相对表达量的影响如图4所示。与正常对照组相比,DSS模型组小鼠结肠组织中、相对表达量极显著上升(<0.01);与DSS模型组相比,DSS+EGCG组、DSS+LBT组、DSS+MBT组和DSS+HBT组小鼠结肠组织中、相对表达量极显著下降(<0.01)。其中,DSS+MBT组和DSS+HBT组接近正常组水平。由此可知,EGCG和茯砖茶均能抑制UC小鼠结肠、基因mNRA表达,可能通过抑制/信号通路来抑制UC小鼠体内炎症反应。

2.5 16 S rDNA的PCR扩增

以GC-341f和534r为引物,选择细菌16 S rRNA-V3区对不同时期小鼠粪便总DNA进行PCR扩增,得到约250 bp的清晰条带(图5),符合DGGE分析。

注:*:与正常对照组相比,P<0.05。**:与正常对照组相比,P<0.01。#:与DSS模型组相比,P<0.05。##:与DSS模型组相比,P<0.01。下同

图4 茯砖茶对UC小鼠JAK2、STAT3 mRNA相对表达量的影响

注:A1、A2为正常对照组;B1、B2为EGCG对照组;C1、C2为HBT对照组;D1、D2为DSS模型组;E1、E2为DSS+EGCG组;F1、F2为DSS+LBT组;G1、G2为DSS+MBT组;H1、H2为DSS+HBT组;M为Marker

2.6 DGGE指纹图谱分析

EGCG和茯砖茶灌喂2周和4周后,小鼠肠道微生物DGGE指纹图谱如图6所示,不同时期EGCG和茯砖茶灌喂处理DGGE图谱数据化处理如表4所示。DGGE图谱中每一条亮带代表至少一种微生物菌种,条带的亮度表示细菌的丰富度,条带越亮,表明该菌相对数量越多。因此,可根据条带数量和丰富度评估茯砖茶对UC小鼠肠道微生物菌群的影响。由表4可知,DSS处理前,所有小鼠肠道微生物正常且基本无差异。经DSS处理1周后,与正常对照组相比,各组小鼠肠道微生物多样性减少,丰富度显著降低(<0.05)。经EGCG和不同剂量茯砖茶灌喂处理1周后,与DSS处理1周结束时相比,各处理组小鼠肠道微生物种类数量增加,其中DSS+HBT组达显著水平(<0.05);与DSS模型组相比,DSS+EGCG组和DSS+MBT组小鼠肠道微生物丰富度显著提高(<0.05)。灌喂处理2周后,与DSS处理1周结束时相比,DSS模型组和各处理组小鼠肠道微生物种类数量增加,其中EGCG对照组与DSS+HBT处理组中肠道微生物种类数量比正常组及其他试验处理组丰富;与DSS模型组相比,DSS+EGCG组、DSS+MBT组和DSS+HBT组小鼠肠道微生物丰富度显著提高(<0.05)。灌喂处理3周后,各处理组小鼠肠道微生物种类数量及丰富度基本达到正常组水平。灌喂处理4周后,各组小鼠肠道微生物数量及丰富度基本一致,与DSS模型组相比,EGCG及茯砖茶处理组小鼠肠道微生物种类数量更加丰富。

注:T0:DSS处理前。T1:DSS处理1周后。F1:灌喂第1周。F2:灌喂第2周。F3:灌喂第3周。F4:灌喂第4周。*表示与DSS处理前相比,差异显著(<0.05),#表示与DSS处理1周后相比,差异显著(<0.05);a表示同一泳道内与正常对照组相比,差异显著(<0.05),b表示同一泳道内与DSS模型组相比,差异显著(<0.05)

Note: T0: before DSS treatment. T1: after one week DSS treatment. F1: the 1st week of feeding. F2: the 2ed week of feeding. F3: the 3rd week of feeding. F4: the 4th week of feeding. * represents a significant difference compared to the before DSS treatment,<0.05. # represents a significant difference compared to the after one week DSS treatment,<0.05. "a" represents a significant difference compared to the control groups in the same lane,<0.05. "b" represents a significant difference compared to the DSS model groups in the same lane,<0.05

2.7 特异性条带测序分析

对DGGE图谱中特异性条带进行切胶测序,将结果通过NCBI Genbank数据库进行对比,结果如表5所示。回收条带所代表的细菌与数据库中的细菌同源性为96%~100%,可归纳为主要的八大优势类群,分别为肠杆菌科、毛螺菌科、疣微菌科()、螺杆菌科()、乳杆菌科()、紫单胞菌科()、理研菌科()和普雷沃氏菌科()。

将与目的条带对应的序列导入16 S rDNA数据库进行比对,通过测序结果可知,DSS造模成功后,小鼠肠道中肠道疾病标志性菌群、致病菌增加,如理研菌科、梭菌科梭状芽孢杆菌()、脱硫弧菌科嗜胆菌()等。有益菌菌群减少,如肠杆菌科、紫单胞菌科、疣微菌科等。

在EGCG及不同剂量茯砖茶灌喂处理后,小鼠肠道微生物大部分恢复正常,肠道中益生菌数量增加,如紫单胞菌科、疣微菌科等。不同治疗时期及不同处理组间存在特异性肠道微生物。EGCG及茯砖茶灌喂1周后,各处理组中毛螺菌科细菌增加。灌喂2周后,EGCG及DSS+MBT组拟杆菌属()细菌增加,HBT组中毛螺菌科细菌增加,DSS+LBT组和DSS+HBT组中紫单胞菌科细菌增加,DSS+EGCG组中出现约氏乳酸杆菌()。灌喂3周后,DSS+MBT组中出现有利于肠道健康的菌;DSS+EGCG组及DSS+HBT组中具有改善肥胖、减轻肠道炎症等作用的疣微菌门艾克曼菌()数量增加。灌喂4周后,DSS+MBT处理组中疣微菌门艾克曼菌增加,DSS+LBT组和DSS+HBT组中出现格氏乳酸杆菌()。上述结果说明EGCG和茯砖茶对UC具有缓解及治疗作用。

表5 DGGE特异性条带测序结果

2.8 小鼠肠道菌群的聚类分析

灌喂EGCG和不同剂量茯砖茶2周后,小鼠生存状态显著改善,且菌群多样性显著增加。对灌喂2周后的小鼠肠道菌群DGGE指纹图谱进行UPGMA聚类分析,结果如图7所示,DSS模型组与HBT对照组各自聚为一簇;在马氏距离0.63处,EGCG对照组与正常对照组、DSS+LBT组与DSS+MBT组、DSS+EGCG组与DSS+HBT组首先各自聚集,然后聚集为一大簇,与DSS模型组相距较远。由此可知,经EGCG及不同剂量茯砖茶灌喂后,小鼠肠道菌群分布更为相似,而DSS模型组小鼠由于没有经过治疗处理,其肠道菌群分布与其他组小鼠具有显著差别。

3 讨论

肠道微生物菌群调节异常可促进炎性肠病的发生和恶化[23],通过粪便菌群移植、益生菌、益生元、膳食疗法等可调节肠道菌群,进行UC预防及治疗[24]。茶因富含多酚类化合物等成分,具有较强的抗氧化、抗炎效果,对UC具有一定改善作用[25]。黑茶中的茯砖茶经冠突散囊菌“发花”后,其化学组分发生了较大变化,分析发现茯砖茶含有茶褐素、茶多糖、有机酸、黄烷醇等诸多活性物质[26-27],以及吲哚类生物碱等具有抗氧化性的冠突散囊菌代谢产物[28]。但茯砖茶是否对DSS诱导的UC小鼠模型肠道炎症及菌群产生积极改善作用,未见相关研究报道。本研究从/炎性信号通路和肠道微生物角度探讨了茯砖茶对UC的改善作用,发现其对UC导致的肠道损伤具有一定的修复和改善作用。

DSS诱导结肠炎发生,促进炎性细胞浸润,增加如IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等促炎细胞因子释放[29-30],导致肠道黏膜发生炎症反应,最终驱动结肠炎向结肠癌转变[31]。/信号通路是炎症发生的重要通路,参与了包括IBD在内的多种疾病的发病机制。JAK抑制剂对UC的治疗有显著疗效[32],抑制/信号通路可改善DSS诱导的UC病程[33]。此外,有研究表明结肠炎的炎症影响了肠道中微生物的多样性和丰富度[34]。本研究中小鼠结肠病理组织切片显示,DSS造模后小鼠结肠组织出现损伤,并伴随炎性细胞浸润,在灌喂EGCG和茯砖茶后,结肠组织损伤得到一定程度改善,以10 mg·kg-1EGCG和150 mg·kg-1茯砖茶两个处理组效果较好,但仍无法恢复到正常对照组水平。此外本研究发现,结肠炎小鼠在DSS诱导后28 d,体内炎性因子水平仍较高,IL-6、IL-8、IL-1、TNF-、IFN-等炎性因子与正常对照组相比显著提高,和基因表达未恢复到正常水平,仍存在炎症和结肠组织损伤。这与Konarska等[35]和Liu等[36]的研究结果一致,说明UC一旦发生,即使生存状态已恢复,但体内炎症水平和部分结肠组织仍存在损伤。灌喂EGCG和茯砖茶后,小鼠血清炎性因子和、基因表达基本回归正常水平。由此可知,通过摄入具有抗炎作用的茯砖茶,对改善UC炎症具有显著作用。

图7 小鼠肠道菌群DGGE图谱UPGMA聚类分析

PCR-DGGE技术是一种广泛用于肠道微生物菌群多样性分析及菌群结构变化研究的便捷方法[37],通过对单个特异条带测序,可鉴定微生物群体关系;图谱中条带数量代表小鼠肠道中微生物种类多少,条带亮度表示该菌群相对数量的多寡,菌群多样性越高,各类细菌之间关联就越密切,丰富度越高,说明该菌相对数量越多,一定程度说明了菌群的稳定性与定植抵抗力[38]。本研究通过茯砖茶对DSS诱导UC小鼠肠道微生物DGGE的指纹图谱分析发现,DSS诱导炎症性肠病导致小鼠肠道微生物多样性及群落丰富度发生改变,经EGCG和茯砖茶治疗后,致病菌减少,益生菌增加,肠道微生物菌群得到改善。

小鼠经DSS造模后,肠道内微生物多样性显著降低;有益菌菌群肠杆菌科、紫单胞菌科、疣微菌科等减少,小鼠肠道致病类细菌增加,理研菌科、梭菌科梭状芽孢杆菌、脱硫弧菌科、肠道沙门氏菌()等细菌的出现,标志着肠道疾病的发生与恶化[39-40]。经EGCG和不同剂量茯砖茶治疗处理后,大部分小鼠肠道微生物恢复正常,肠道中毛螺菌科、紫单胞菌科、疣微菌科等益生菌数量增加。此外,DSS+EGCG、DSS+MBT和DSS+HBT处理组中分别出现约氏乳酸杆菌、菌、格氏乳酸杆菌,及共同含有的疣微菌门艾克曼菌等益生菌,明显改善了小鼠肠道环境,抑制肠道炎症发展,使UC小鼠的症状得到有效缓解,与Stenman等[41-43]的研究结果一致。其中,高剂量茯砖茶对UC有明显缓解作用,与胡安恺等[18]研究结果相符。DGGE指纹图谱UPGMA聚类分析表明,DSS模型组单独聚为一类;HBT对照组聚为一类,可能是由于茯砖茶拥有独特的减肥降脂和肠道调节的生理功能,导致其与正常对照组在分类上存在一定差别;EGCG对照组和正常对照组小鼠肠道菌群较为相似;DSS+LBT组和DSS+MBT组小鼠肠道菌群较为相似;DSS+EGCG组和DSS+HBT组小鼠肠道菌群较为相似。

综上所述,DSS诱导的UC可导致小鼠炎症水平升高、结肠组织受损,肠道微生物菌群发生改变,严重影响小鼠生存质量,EGCG和茯砖茶在一定程度上改善了UC小鼠体内炎症水平和肠道菌群的变化、修复肠道损伤。本研究从/炎性信号通路和肠道微生物的角度探讨了茯砖茶对UC的改善作用,为茯砖茶的药理功能研究提供了一定理论基础。

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Effects of Fu Brick Tea on Inflammation and Intestinal Microflora Diversity in Mice with DSS-induced Ulcerative Colitis

HUANG Xiangxiang1, TAN Ting1, YU Lijun1,2,3*, WANG Kunbo1,2,3, HUANG Jian'an1,2,3, XU Shiyu1, LIU Zhonghua1,2,3*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

In this study, we investigated the effects of Fu brick tea on the anti-inflammationand intestinal microflora of ulcerative colitis (UC) mice induced by Dextran sulfate sodium (DSS). Sixty C57BL/6 female mice were randomly divided into the normal control group, 10 mg·kg-1EGCG control group, high dose brick tea (300 mg·kg-1, HBT) control group, DSS model group, DSS+10 mg·kg-1EGCG group, DSS+low dose brick tea (100 mg·kg-1, LBT) group, DSS+middle dose brick tea (150 mg·kg-1, MBT) group and DSS+HBT group, with the control groups n=5 and the treatment groups n=9. After 1 week of DSS modeling, the mice were gavaged for 4 weeks. The mice were executed after 5 weeks of the treatments. The histopathological changes of mice colon were observed, and the disease activity index (DAI) of mice colitis was assessed. The levels of IL-6, IL-8, IL-1, TNF-and IFN-inflammatory factors in mice serum and the expression levels ofandgenes in mice colon tissues were measured. The intestinal microflora of mice was analyzed by PCR-DGGE and clone sequencing techniques. The results show thatcompared with the DSS model group, the quality of survival and colonic tissue morphology of mice were significantly improved after feeding EGCG and different concentrations of brick tea, and the levels of inflammatory factors IL-6, IL-8, IL-1, TNF-and IFN-in mice serum were significantly reduced (<0.05). Moreover, the expressions ofandgenes were significantly reduced (<0.05) JAK2/STAT3 inflammatory signaling pathway was inhibited; and intestinal microflora diversity and richness were increased significantly. The dominant bacterial flora in different treatment groups werechangedaswell. In conclusion, Fu brick tea can ameliorate DSS-induced UC injury by inhibiting/inflammatory signaling pathway and modulating intestinal microflora diversity.

Fu brick tea, ulcerative colitis, inflammation factors, intestinal microflora diversity, PCR-DGGE

S571.1;R574.1

A

1000-369X(2021)05-681-14

2021-02-23

2021-04-15

国家重点研发计划(2018YFC1604403)、湖南省科技厅黑茶重点研发项目(2017NK2180)、湖南省大学生创新创业训练计划(201910537089)、财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系

黄翔翔,男,博士研究生,主要从事茶叶功能成分及药理研究。*通信作者:yulijun_tea@qq.com;larkin-liu@163.com

(责任编辑:黄晨)

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