基于激光介导富集的表面增强拉曼分析

唐文涛，李圣凯，王 昚，陈 龙，陈 卓

（1.湖南大学化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室,分子科学与生物医学实验室,长沙410082；2.澳门大学科技学院,澳门999078）

痕量目标分析物的特异性检测在生化分析和环境监测等领域具有重要意义［1~3］.目前，已开发出多种光谱技术用于痕量待测物的分析，其中表面增强拉曼散射（SERS）技术被认为是最有前途的技术之一［4，5］.SERS技术具有众多优势［6~8］：（1）能够反映待测物内在的分子指纹信息；（2）对待测样品的损伤小，检测灵敏度高，甚至可以实现单分子检测；（3）抗光漂白和抗碳化能力强；（4）基于拉曼光谱带宽窄的特点，在单一波长光激发下能够实现多目标物的分析；（5）水的拉曼散射信号极其微弱，不会造成大的背景干扰.根据电磁场增强机理，SERS信号强度与增强基底电磁场热点附近的待测物分子数量呈正相关，因而实现SERS基底附近待测物分子的有效富集是实现痕量分析的关键［9，10］.

研究者开发了多种待测物分子的有效富集方法以实现灵敏的SERS分析，主要有靶标诱导捕获法［11~13］、超疏水界面诱导浓缩法［14~17］和吸附剂辅助浓缩法［18，19］.其中，靶标诱导捕获法需要特定的靶标以选择性地捕获分子，但是引入的拉曼标签会造成背景干扰；超疏水界面诱导浓缩法利用不润湿的底物来浓缩水溶性分析物，但是超疏水界面的构建方法复杂且昂贵；而吸附剂辅助浓缩法在富集待测物时，使用的吸附剂会导致待测物难以靠近电磁场热点附近.上述3种方法都属于被动的分子吸附方式，捕获效率低且耗时长.近年发展起来的液滴蒸发自组装浓缩法有利于主动富集待测物，然而当蒸发液滴浓缩到较小时会发生Cassie-Wenzel转变，导致“咖啡环效应”［20~22］.因此，有必要提出一种能主动高效富集待测物，同时能有效避免“咖啡环效应”的策略，以实现痕量待测物的可靠SERS分析.

本文构建了一种新的激光介导的待测物富集策略，实现了水溶液中9，10-双苯乙炔基蒽（BPEA）分子的痕量SERS分析.基于石墨烯隔离的金纳米晶（GIAN）颗粒良好的SERS性能以及能够在水-二氯甲烷（DCM）两相界面自组装的特点，将少量GAIN颗粒和DCM加入到含有待测物BPEA的水溶液中并充分振荡，在溶液底部形成含有GIAN颗粒的DCM小油滴.利用BPEA分子在DCM中的分配系数大于其在水中的分配系数以及富含π电子体系的GIAN外壳与BPEA的π-π相互作用［23，24］，在激光的照射下具有优异的光热升温能力的GAIN［25］大量产热使得小油滴上下往复运动，在34 min内实现了BPEA分子的高效富集，最后通过SERS测试证明该策略能够实现痕量分析物的检测，实验原理如Scheme 1所示.

Scheme 1 Mechanism of laser⁃mediated analyte enrichment and detection of BPEA

本文构建的激光介导的痕量待测物富集策略的整个富集过程均在液相体系中进行，在一定程度上避免了因“咖啡环效应”带来的SERS信号波动，且利用GIAN位于拉曼静默区（1800~2800 cm−1区间［7］）的特征峰作为内标可以提高拉曼定量分析的准确性，因而在生化分析和环境监测等领域具有潜在的应用价值.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

气相SiO2购于上海麦克林生化科技有限公司；结晶紫（CV）、罗丹明6G（R6G）、孔雀石绿（MG）和罗丹明B（RhB）购于西格玛奥德里奇生物试剂公司；9，10-双苯乙炔基蒽（BPEA）购于上海萨恩化学技术有限公司；四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）和氢氧化钠（NaOH）购于上海国药试剂公司；氢氟酸（HF）、二氯甲烷（DCM）、环己烷（CH）、甲醇（MeOH）和乙酸乙酯（EA）均购于长沙化学试剂公司.所用试剂均为分析纯且未经处理直接使用；实验用水为电阻率18.2 MΩ·cm的二次蒸馏水（ddH2O）.

JEOL 2010型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；Zeta sizer Nano ZS90型激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；inVia reflex型激光共聚焦拉曼光谱仪（英国雷尼绍公司）.

1.2 实验过程

1.2.1 GIAN的合成参考文献［25］报道的化学气相沉积法制备石墨烯隔离的金纳米晶（GIAN）.称量1.0 g气相SiO2加入到盛有80 mL甲醇的250 mL圆底烧瓶中，超声1.5 h；加入6 mL 1%HAuCl4甲醇溶液和80 mL甲醇，继续超声0.5 h；通过旋转蒸发去除上述混合溶液中的甲醇，将获得的淡黄色粉末置于45°C烘箱中干燥过夜；然后将干燥的粉末充分研磨，置于管式炉中进行CVD生长（实验条件：加热温度为1000°C，升温时间为50 min，恒温时间为25 min，CH4和H2流量分别为150和20 cm3/min）；将得到的粗产物转移至HF中以刻蚀SiO2模板；最后用超纯水将GIAN产物洗涤至中性，置于烘箱中干燥得到GIAN粉末.

1.2.2 GIAN的稳定性测试分别称量0.6 mg GIAN置于2 mL DCM，H2O，CH，MeOH和EA溶剂中浸泡0，3，6，12或24 h后，测量GIAN颗粒相应的拉曼光谱（532 nm激光，强度为50 mW）.

1.2.3 GIAN的SERS效应探究将不同浓度的CV和R6G与1 mg GIAN粉末共孵育30 min，然后将其转移至载玻片上，自然风干，最后测量相应的拉曼光谱.

1.2.4 称量瓶的处理将称量瓶放置在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min，使其内壁亲水性增强，然后用ddH2O进行多次洗涤，最后置于通风处自然晾干.

1.2.5 “水包油”结构SERS基底的构建及运动能力探究将含有50 μg GIAN颗粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL ddH2O的称量瓶中，充分振荡10 min，静置.将称量瓶转移至超声仪中进行超声处理，并用相机记录超声前后溶液中小油滴的位置变化.

1.2.6 超声介导的相界面待测物富集体系的构建将含有50 μg GIAN颗粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL 100 nmol/L BPEA水溶液的称量瓶中，充分振荡10 min，静置.将称量瓶转移至超声仪中进行超声处理，用相机记录超声前后溶液中小油滴的颜色变化.

1.2.7 激光介导的相界面待测物富集与检测体系的构建将含有50 μg GIAN颗粒的50 μL DCM溶液加入到盛有15 mL不同浓度BPEA水溶液的称量瓶中，充分振荡10 min，静置.用655 nm激光（强度为2 W/cm2）对准油滴加热34 min，用相机记录超声前后溶液中小油滴的颜色变化，最后将油滴转移至载玻片表面，自然风干后测量其拉曼光谱.

2 结果与讨论

2.1 GIAN的表征

由图1（A）所示透射电子显微镜（TEM）照片可见，GIAN的微观形貌为球型，平均粒径约为53 nm.从图1（B）所示高分辨透射电子显微镜（HRTEM）照片可以观察到GIAN内部Au核外面包覆有少层石墨烯，石墨烯壳层厚度约为1.5 nm，晶格间距约为0.34 nm.如图1（C）所示，GIAN的ζ电势约为−4.76 mV.在图1（D）所示紫外-可见吸收（UV-Vis）光谱图中GIAN有2个特征吸收峰，其中位于~560 nm处的峰来源于内部Au核的局域表面等离子体共振吸收，位于~265 nm处的峰来源于外层石墨烯壳的特征吸收.

Fig.1 TEM image(A)and HRTEM image(B)of GIAN,zeta potential(C)and UV⁃Vis spectrum(D)of GIAN aqueous solution

2.2 GIAN的稳定性

如图2（A）所示，GIAN颗粒有3个来源于石墨烯外壳的拉曼散射特征峰，分别为D（1350 cm−1），G（1590 cm−1）和2D（2700 cm−1）峰，与前文报道结果一致［26，27］.为了进一步探究GIAN颗粒在不同溶剂中的稳定性，将GIAN颗粒分别在DCM，H2O，CH，MeOH和EA中浸泡0，3，6，12和24 h，然后分别测量其拉曼光谱.如图2（B）所示，GIAN颗粒在不同溶液中浸泡不同时间，其2D峰强度始终无明显变化，证明GIAN在不同有机溶剂中具有优异的稳定性.

Fig.2 Stability study of GIAN

2.3 GIAN的SERS效应

分别以CV和R6G为模型分子，探究了GIAN作为SERS基底的增强效果.如图3所示，100 μmol/L CV，1 mmol/L R6G，10 μmol/L MG和1 mmol/L RhB水溶液的本征拉曼信号非常微弱，而1 μmol/L CV，10 μmol/L R6G，1 μmol/L MG和10 μmol/L RhB在GIAN基底的作用下均检测到非常强的SERS信号.上述实验结果表明，GIAN颗粒具有良好的SERS效应，能够作为良好的SERS分析平台.

Fig.3 Raman spectra of CV(A),R6G(B),MG(C)and RhB(D)with or without GIAN incubation under 633 nm(17 mW)laser excitation

2.4 GIAN的液-液界面自组装

如图4（A）~（C）所示，未经任何修饰的GIAN沉积于盛有H2O和有机溶剂的玻璃瓶底部，说明GIAN在H2O和有机溶剂中的溶解度有限.然而，GIAN能够自发地组装于H2O和有机溶剂两相界面处，这可能因为H2O和有机溶剂界面处的界面能很低且热波动与自由能之间相对平衡，从而促使GIAN在两相界面处自组装［28，29］.如图4（D）和（E1）所示，本工作构建的“水包油”体系中形成的小油滴沉于称量瓶的底部，然后将构建的“水包油”体系进行超声处理（实验步骤见1.2.5节）.由于超声波空化作用，小油滴附近产生气泡，油滴的浮力变大从而向上移动［图4（E2）］，超声停止一段时间后油滴再次下沉，循环往复数次后小油滴的体积缩小［图4（E3）］，说明在超声作用下有部分DCM挥发.此外，由于称量瓶经NaOH溶液处理后其内壁亲水性较好，小油滴不会黏附在瓶底和瓶壁，从而不会阻碍小油滴的运动.上述实验结果表明，本文构建的“水包油”体系在外力作用下能够自由移动并促使小油滴浓缩，基于GIAN优异的SERS效应，有望构建高效的待测物浓缩体系以实现灵敏的SERS分析.

Fig.4 Self⁃assembly of GIAN in immiscible two⁃phase interfaces

2.5 激光介导的待测物富集与检测体系的构建

上述实验结果表明，超声有助于“水包油”体系中小油滴的浓缩，以微溶于水的BPEA分子为模型，进一步探究了该策略的富集效率（实验步骤见1.2.6节）.实验过程中发现，小油滴附近产生气泡且上下往复运动，超声130 min后无色的小油滴浓缩成极其微小的黄绿色油滴（图5），证明小油滴能够富集BPEA，且GIAN密集分布在油滴表面，没有产生明显的咖啡环效应.然而，这一通过超声富集BPEA的方法耗时太长，在实际的分析检测中可行性较差.

Fig.5 Enrichment of BPEA in oil⁃in⁃water treated with ultrasound

前文［25］已报道GIAN具有良好的光热转换效果，且热能够加速分子的运动.后续实验利用激光诱导油滴内部的GIAN颗粒升温（实验步骤见1.2.6节）.实验中发现，小油滴的运动状况与超声处理相类似，小油滴附近产生气泡并上下往复运动，随着时间的延长小油滴的体积缩小，且在34 min后无色的小油滴浓缩成极其微小的黄绿色油滴（图6），说明激光加热的方式对BPEA的富集效率高于超声处理.我们推测导致上述实验结果的可能原因如下：BPEA分子在DCM中的分配系数大于其在H2O中的分配系数，富含π电子体系的GIAN外壳能够通过π⁃π相互作用与BPEA结合，激光介导GAIN产生大量的热使得油滴快速地上下往复运动，并伴随着部分DCM的蒸发，从而实现BPEA分子的高效富集和浓缩.

Fig.6 Enrichment of BPEA in oil⁃in⁃water under laser irradiation

通过拉曼测试进一步证实了激光介导的高效富集效率.如图7（A）所示，未观察到单独BPEA以及BPEA/GIAN混合体系的拉曼信号；而BPEA/GIAN混合体系经激光照射后，可明显观察到位于2180 cm−1处（红色方框标注）的拉曼散射特征峰，此峰来源于BPEA分子中C≡C的伸缩振动，证明激光加热的方式能够提高SERS分析的灵敏度.基于此，进一步利用构建的富集方法实现了BPEA分子的定量分析.如图7（B）和（C）所示，BPEA在30~1000 nmol/L范围内与其拉曼强度呈一定的线性关系，其检出限低至10 nmol/L.值得注意的是，利用GIAN位于拉曼静默区的2D峰作为内标时［图7（C）］，相关系数由0.739提升至0.975，这充分说明利用内标可以提高拉曼定量分析的准确性.此外，本工作构建的富集方法具有优异的重现性（见图8），在实际的SERS分析应用中具有一定的应用潜力.

Fig.7 Laser⁃mediated enrichment and detection of analytes

Fig.8 Reproducibility of the laser⁃mediated enrichment strategy

3 结 论

基于兼具有光热和SERS效应的GIAN颗粒能够在H2O-DCM两相界面自组装的特点，构建了激光介导的待测物富集策略，实现了微溶于水的BPEA分子的痕量SERS分析.实验结果表明，激光介导策略实现了BPEA的有效富集，因为BPEA分子在DCM中的分配系数大于其在H2O中的分配系数，GIAN能够通过π⁃π相互作用与BPEA结合以及在激光的照射下GAIN大量产热使得油滴上下往复运动，从而实现BPEA分子的高效富集.SERS分析结果表明，利用此富集策略可实现100 nmol/L BPEA的检测，而将同浓度的BPEA分子与GIAN直接混合则检测不到任何信号.基于此，进一步实现了BPEA的定量分析检测，利用GIAN位于拉曼静默区的2D峰作为内标提高了拉曼定量分析的准确性，且证实了该富集方法具有良好的重现性.值得一提的是，同一体系中通过超声的方式介导BPEA的富集需用时130 min，远高于本工作构建的激光介导的富集方法.此外，本工作构建的激光介导的富集方式在一定程度上避免了因“咖啡环效应”带来的信号波动，有望实现复杂样品中痕量分析物的高效富集与灵敏的SERS检测.