基于球形金-银纳米笼比色法检测谷胱甘肽和谷胱甘肽转移酶

肖传豪，穆之琳，陈郑博

(1. 濮阳职业技术学院，河南大学 濮阳工学院，河南 濮阳 457000；2. 首都师范大学 化学系，北京 100048)

谷胱甘肽（GSH）是细胞内最丰富的巯基化合物，细胞GSH 浓度的变化与衰老、心脏病、癌症、白细胞减少、肝损伤、HIV 和神经退化性疾病有关[1-2]. 谷胱甘肽转移酶（GST）在肝细胞液中含量较高，通过催化GSH 与活性代谢产物结合，在降低毒性和促进尿排泄方面发挥重要作用[3]. GST 已被证明是肺癌、卵巢癌、乳腺癌和胃癌等肿瘤的重要标志物[4].

目前已发展了多种分析方法检测GSH，如色谱法[5-6]、光度法[7]、质谱法[8]和免疫发光法[9]等.对于GST 检测，目前已发展了一些检测方法，包括比色法、生物发光探针法、荧光微板法、金属有机抑制剂和光学方法[10-14]. 然而，这些方法由于存在成本高、灵敏度低、预处理繁琐等缺点[15]，限制了它们在生化分析中的应用. 而比色法因其可简单地用肉眼读出而备受关注[16-17].

本文以制备的具有过氧化物酶活性的球形Ag-Au 纳米笼作为催化剂，催化3,3′,5,5-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢（H2O2）反应，生成蓝色的TMB 氧化产物（oxTMB）并在652 nm 出现紫外吸收峰. 不同浓度GSH 的加入造成oxTMB 被还原，从而引起溶液由蓝色变浅，652 nm 处的吸光强度减小. GST 和GSH 的特异性作用使得GSH 对TMB和H2O2的反应抑制程度减弱，颜色由浅变成深蓝色，652 nm 处的吸光度增强. 从而实现了一种简单、快速、灵敏、专一检测GSH 和GST 的比色方法，并用于人血清样品中的GSH 和GST 的测定，获得了满意的结果.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂UV-2550 型紫外可见（UVvis）吸收光谱仪（苏州生产）；H-7560 型透射电子显微镜（日本日立公司）；SU-8000 型透射电子显微镜（日本日立公司）.

硝酸银（99.7%）、氯金酸（99.9%）、柠檬酸钠（99%）、醋酸（98%）、醋酸钠（99.5%）、过氧化氢、3,3′,5,5-四甲基联苯胺（TMB）（99%）、谷胱甘肽（GSH）（98%）、谷胱甘肽转移酶（GST）（阿拉丁试剂（上海）有限公司）, 试剂均为分析纯，无任何纯化步骤.

1.2 球形纳米Ag 的制备基于AgNO3还原法[18]，将油浴锅加热至95 ℃，向油浴加热的烧瓶中加入50 mL 甘油-水混合物（10 mL 甘油+40 mL 水），在1 200 r/min 的 剧 烈 搅 拌 下，向 溶 液 中 添 加9 mg AgNO3. 然后迅速向溶液中加入1 mL 3%柠檬酸钠溶液，在95 ℃下反应1 h 后，自然冷却到室温，得到粒径为40 nm 球形银溶液.

1.3 球形Ag-Au 纳米笼的制备取1.2 mL 上述制备好的纳米银溶液和3.6 mL 蒸馏水于10 mL 离心管中. 将0.1 mol/L 的氯金酸溶液稀释至3.75 mmol/L，然后移取1.2 mL 氯金酸（3.75 mmol/L）分5 次加入到上述溶液中，每次240 μL，每隔10 min 加一次，直至加完. 由此得到HAuCl4刻蚀纳米银形成的球形Ag-Au 纳米笼溶液，放置在4 ℃条件下备用.

1.4 实验方法对于GSH 的检测，通常将100 μL Ag-Au 溶液、300 μL 5 mmol/L TMB、300 μL 5 mmol/L H2O2、300 μL HAc-NaAc（pH 3.6）混合均匀，并在室温下孵化30 min. 然后加入100 μL 不同浓度的GSH溶液并在常温下反应5 min，在室温下记录 400～800 nm 处的紫外吸收光谱，记录652 nm 波长处的oxTMB 的吸光度值. 以该值为纵坐标（y），GSH 浓度c为横坐标（x）绘制标准曲线，用以测定样品GSH含量.

对于GST 的检测，分别将100 μL 900 μmol/L GSH 溶液和100 μL 不同浓度的GST 溶液混合，在37 °C 下孵化3 h. 然后向上述溶液再加入300 μL HAc-NaAc（pH 3.6）、300 μL 5 mmol·L-1TMB、300 μL 5 mmol/L H2O2、100 μL Ag-Au 溶液. 充分混合后反应10 min，记录 400～800 nm 处的紫外吸收光谱，记录652 nm 波长处的oxTMB 的吸光度值. 以该值为纵坐标（y），GST 质量浓度ρ为横坐标（x）绘制标准曲线，以此测定样品GST 含量.

2 结果与讨论

2.1 实验原理如图1，具有大表面积的球形Ag-Au 纳米笼作为催化剂，催化TMB 和H2O2反应，无色的TMB 被氧化成蓝色的oxTMB，并在652 nm处观察到清晰的紫外吸收峰. 在Ag-Au 纳米笼-TMB-H2O2体系中加入GSH 后，652 nm 处的吸光度降低，溶液颜色从蓝色变为浅蓝色，最后到无色.这种现象是由于oxTMB 被GSH 还原所致[19]. 对于GST，它能够特异性结合GSH，因此，GST 的加入将有效地抑制oxTMB 被GSH 还原，导致652 nm处的吸光度增加，溶液颜色从无色变为蓝色. 因此，可以通过652 nm 处的oxTMB 的吸光度和颜色的变化来测定GSH 和GST 的含量.

图1 利用Ag-Au 纳米笼催化TMB-H2O2 反应比色检测GSH 和GST 示意图Fig. 1 Schematic of colorimetric detection of GSH and GST based on TMB-H2O2 reaction catalyzed by Ag-Au nanocage

2.2 Ag-Au 纳米粒子表征如图2，TEM（图2（a））和SEM（图2（c））图像显示了Ag-Au 空心笼的纳米结构. HRTEM 图像也清楚地显示了Au-Ag 纳米笼的形成（图2（b））. 加入氯金酸前后形成的纳米Ag和Ag-Au 纳米笼的UV-vis 吸收光谱如图2（d）所示，随着氯金酸的加入，溶液的吸收峰从427 nm 处红移到544 nm. 这些结果都证实了球形纳米银成功被氯金酸刻蚀，同时氯金酸还原后生成的纳米金沉积在刻蚀的纳米银表面形成Ag-Au 纳米笼.

图2 Ag-Au 纳米笼的纳米粒子表征Fig. 2 Characterization of nanoparticles in Ag-Au nanocages

2.3 反应条件的优化考察了不同浓度（0.25，0.5，0.75，1 mmol/L）氯金酸对Ag-Au 纳米笼的吸光度的影响（图3）. 实验结果表明，随着氯金酸浓度的增加，溶液的吸光度先增大后减小. 当氯金酸浓度为0.75 mmol/L 时，此时544 nm 处的溶液吸光度达到最大，表明此浓度下的Ag-Au 纳米粒子催化能力最强. 所以，0.75 mmol/L 为氯金酸的最佳反应浓度. 考察了不同c(TMB)/c(H2O)（1∶1，1∶2，1∶10，1∶20，5∶1，10∶1）对溶液吸光度的影响. 如图4，当TMB 为10 mmol/L，H2O2浓度为10 mmol/L 时，652 nm 处的吸光度接近最大，又鉴于如果H2O2过剩，过剩的H2O2将和GSH 反应，故选用10 mmol/L TMB 和10 mmol/L H2O2用 于 后 续 实 验. 根 据 文献[20]，当pH 高于4 时，Ag 纳米粒子的催化效果会使H2O2会分解为H2O 和O2，而不是OH 自由基，故将pH 控制在3.6 左右. 因此，本实验选择pH 3.6的HAc-NaAc 缓冲溶液.

图3 不同浓度氯金酸对Ag-Au 纳米笼吸光度的影响Fig. 3 Effect of different concentrations of chloroauric acid on the absorbance of Ag-Au nanocages

图4 TMB/H2O2 浓度比对oxTMB 溶液吸光度的影响Fig. 4 Effect of TMB/H2O2 concentrations on the absorbance of oxTMB

2.4 灵敏度与线性范围在最佳反应条件下，对不同浓度的GSH（终浓度：0，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0，2.0 μmol/L）进行了定量检测，结果如图5 所示. 无GSH 存在时，Ag-Au 纳米笼很容易催化TMB 和H2O2反应，生成蓝色的oxTMB 溶液，且在652 nm处存在出现很强的吸收峰；随着GSH 浓度的增加，652 nm 处的吸光度逐渐降低，相应地，溶液颜色从蓝色逐渐变为浅蓝，最终为无色（图5（a）内插图），表明oxTMB 能被GSH 还原. 而且，652 nm 处的吸光度值随着GSH 浓度的对数值增加而增加，在0.5～1.0 μmol/L 范围内线性减小，其线性方程为y=-0.122-5.231x，相关系数R2为0.986（图5（b）），相对标准偏差（RSD）小于3.1%（n=3），表明此方法可用于定量检测GSH. 当GST 被加入到Ag-Au 纳米笼-TMB- H2O2-GSH 溶液时，由于GST 和GSH 能特异性结合，导致652 nm 处吸光度增加，溶液颜色由无色变成蓝色（图6（a））. GST 在1～50 mg/L 范围内时，GST 溶液的质量浓度（x）对数值与其吸光度值（y）呈良好的线性关系，其线性方程为y=0.855+0.01x，相关系数R2为0.999（图6（b）），RSD 小于2.8%（n=3），方法的检出限（3 倍信噪比）为1 nmol/L.以上说明该方法对GSH 和GST 检测具有较高的灵敏度和稳定性.

图5 最佳反应条件下不同浓度GSH 溶液紫外检测光谱曲线Fig. 5 The UV detection spectra of GSH solutions with different concentrations under the optimal reaction conditions

图6 GST 紫外检测光谱曲线Fig. 6 The UV detection spectra of GSH solutions

2.5 选择性选择5 种常见物质（谷氨酸、半胱氨酸、组氨酸、葡萄糖和甘氨酸）作为干扰物质，并以2 μmol/L 的浓度于上述最优反应条件下检测. 结果表明，除了GSH 引起652 nm 处吸光度值的明显改变，其它3 种干扰物均不会出现响应. 然后分别在这5 种干扰物-Ag-Au 纳米笼-TMB-H2O2体系中加入1 mg/L GST，几乎未引起任何吸光度的变化. 这些结果表明该方法对GSH 和GST 有足够的特异性，这归因于GSH 与oxTMB 以及GSH 和GST 之间的特异性相互作用.

2.6 实际样品分析通过检测新鲜人血清中的GSH 和GST，研究了本文方法在生物环境中的传感性能. 将新鲜人血清稀释100 倍，使GSH 浓度在本实验的线性范围内. 为了测量回收率，分别添加不同含量的GSH 和GST 进行加标回收实验，结果见表1. 样品的平均回收率为95%～103.37%，RSD不大于5.6%，说明本方法可用于真实临床样本中的GSH 和GST 的检测.

表1 血清样品中GSH 和GST 回收结果（n=3）Tab. 1 Recovery results of GSH and GST in serum samples (n=3)

3 结论

建立了一种高灵敏和选择性的比色法用于GSH 和GST 的检测. Ag-Au 纳米笼表现出类似过氧化物酶的活性，催化TMB 和H2O2反应，伴随着蓝色oxTMB 及652 nm 处紫外吸收峰的形成. 为了提高检测体系的灵敏度，优化了TMB 浓度、H2O2浓度、溶液pH 值检测条件. 研究表明，当 TMB 浓度为 5 mmol/L，H2O2浓度为 10 mmol/L，在pH 3.6的HAc-NaAc 溶液里取得最优检测结果，且具有优异的选择性. 随着GSH 浓度的增加，Ag-Au 纳米笼的吸光度在0.5～1.0 μmol/L 范围内呈线性减小；随着GST 质量浓度的增加，Ag-Au 纳米笼的吸光度在1～50 mg/L 范围内呈线性增加.