miR-223通 过 靶 向ARMCX1基 因 调 控宫颈癌细胞的增殖和侵袭

郭 镜，陈 丹

（锦州医科大学附属第三医院康复科，辽宁锦州 121001）

宫颈癌是妇女中发病率较高的一种癌症，严重影响妇女的身心健康[1]。Arm重复蛋白1（ARMCX1）是Arm蛋白家族的成员之一。文献报道其在宫颈癌组织中呈高表达，但在正常宫颈组织中却低表达，沉默ARMCX1能抑制siha细胞增殖，诱导细胞凋亡，在宫颈癌的发生发展中发挥癌基因的作用[2-4]。miRNA是一类短链非编码RNA，其长度为18~22个碱基，通过对其靶mRNAs的降解或抑制蛋白翻译而调控目的基因的表达。在宫颈癌中已发现许多miRNA参与肿瘤细胞的发生发展进程[5-6]。文献报道miR-223在宫颈癌中具有抑癌基因作用，过表达miR-223能够抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移[7-8]。然而，miR-223与ARMCX1在宫颈癌中是否存在靶向调控关系尚未见报道。因此，本研究明确miR-223对宫颈癌siha细胞增殖与侵袭影响以及对ARMCX1的调控作用，期望为宫颈癌的治疗寻求新的靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集锦州医科大学附属第三医院2017年1月至2019年12月经病理组织学确诊的30例宫颈癌患者的癌组织和其对应的癌旁组织（距相应癌缘＞5 cm）。年龄25~74岁，平均55岁。按照2011年宫颈癌诊断行业标准[9]和宫颈癌FIGO分期标准[10]进行分 级 分 期。病 理 分级：1级11例，2级13例，3级6例。临床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例。

纳入标准：纳入病例均为宫颈鳞癌患者；术前未接受放疗或者化疗；没有其他基础代谢病。排除标准：有基础代谢病；病例为非宫颈鳞癌患者；术前接受放化疗或影响标本病理改变的药物治疗等。本研究通过锦州医科大学附属第三医院医学伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器人宫颈癌细胞siha购于中国科学院上海生命科学院细胞库，DMEM培养基、胎牛血清购于Invitrogen公司。鼠抗人ARMCX1抗体、鼠抗人β-actin抗体购于Santa Cruz公司。CCK8检测试剂盒、荧光素酶报告基因载体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司，Matrigel基质胶购于BD Biosciences；Transwell小 室 购 于Millipore。miR-223模拟物、阴性对照NC mimic和真核表达质粒GV230-ARMCX1（不含3'-UTR）、对照空载体GV230由上海吉玛公司合成；miRNA提取、miRNA cDNA合成试剂盒和miRNA实时荧光定量PCR检测试剂盒由上海吉玛公司提供。

1.3 细胞培养及转染取生长状态良好的siha细胞于100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，在含50 mL/L二氧化碳、37℃培养箱中培养。待细胞汇合至70%~80%，按Lipofectamine 2000试剂说明书操作，按后续实验设计分别转染siha细胞。将ARM⁃CX1-WT和ARMCX1-MUT荧光素酶报告基因与NC mimic或miR-223 mimic共转染siha细胞48 h(NC mimic+WT组、miR-223 mimics+WT组、NC mimic+MUT组 和miR-223 mimics+MUT组)检 测荧光素酶活性。将miR-223 mimic或NC mimic转染至siha细 胞 中(NC mimic组和miR-223 mimics组)，转染24 h进行CCK8和Transwell实验。另将miR-223 mimic分 别 与GV230-ARMCX1或GV230-NC共 转染siha细胞(miR-223+GV230-ARMCX组和miR-223+GV230-NC组)中，转 染24 h进 行CCK8和Transwell实验。

1.4 Real-time PCR检测miR-223及ARMCX1的表达取1.1项中各组30 mg宫颈组织标本，按照操作说明书提取总RNA并测定RNA浓度。取RNA样品1 μL，12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。miRNA逆转录和定量分析（37℃反应60 min，85℃灭活5 min）。Real-time PCR检测miR-223的表达，40个循环（95℃10 s，60℃20 s，72℃10 s）。同时逆转录反应合成cDNA，以1 μL cDNA为模板，Real-time PCR检测ARMCX1 mRNA的表达，40个循环（95℃10 s,95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s）。用U6 RNA和GAPDH作内参，计算2－ΔΔCt法观察miR-223及ARM⁃CX1 mRNA的相对表达。

1.5 CCK8实验和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力按1.3项分组转染24 h进行实验。CCK8实验：将转染24 h的siha细胞，加入96孔板（500个/孔），每组设3个复孔。待细胞贴壁，每孔加10 μL CCK8试剂，37℃培养箱孵育2 h，酶标仪检测A值(波长450 nm)。分别检测0、24、48、72 h的A值。Transwell实验：将无FBS的DMEM培 养 液和matrigel按8∶1混 合，取60 μL加入Transwell小室，培养箱中过夜。实验前取无FBS的DMEM培养基100 μL加 到小室中，培 养30 min后，将 转 染24 h的siha细 胞 悬 液200 μL加 到Millicell小室中，下室加入600 μL条件培养基。继续培养24 h后取出小室，PBS漂洗2次，用棉签擦去未穿膜细胞，甲醛固定细胞，结晶紫染色，倒置显微镜下观察拍照并计数穿膜细胞的数目。

1.6 双荧光素酶实验检测miR-223和ARMCX1的关系根据TargetScan生物信息学软件，预测miR-223与ARMCX1 3’UTR存在结合位点，提示ARM⁃CX1可能是miR-223的直接靶基因。为证实该推测，按1.3项分组构建了ARMCX1-WT和ARMCX1-MUT荧光素酶报告基因重组载体质粒。取生长状态良好的各组siha细胞调节密度至1×105/mL接种24孔板，培养过夜。培养48 h按照试剂盒说明书检测萤火虫荧光值和海肾荧光值。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光值/海肾荧光值。

1.7 Western blotting检测蛋白表达将NC mimic组和miR-223 mimics组细胞转染48 h，收集siha细胞并裂解提取总蛋白，测定浓度。用80 g/L SDSPAGE胶进行电泳后将目标蛋白转移至PVDF膜，在室温条件下以50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，然后加入ARMCX1抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜。TBST缓冲液进行5次洗膜后加入二抗，室温孵育2 h。ECL曝光。以β-actin作为内参，目的蛋白表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.8 统计学分析采用SPSS 17.0统计分析软件。数据以（±s）表示，实验数据符合正态分布及方差齐性，采用两独立样本t检验进行两组之间差异的比较；多组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t方法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 宫颈组织中miR-223及ARMCX1的mRNA相对表达情况Real-time PCR结果显示，miR-223在宫颈癌组织中的相对表达明显低于癌旁组织（0.620±0.157vs.1.670±0.527），差异有统计学意义（t=−10.614，P＜0.001）；而 宫 颈 癌 组 织 中ARMCX1的mRNA相对表达明显高于癌旁组织（1.870±0.691vs.0.750±0.375），差异有统计学意义（t=7.712，P＜0.001，图1）。

图1 宫颈癌组织中miR-223和ARMCX1的表达比较Fig.1 The relative expression of miR-223 and ARMCX1 in cervical cancer tissues

2.2 Real-time PCR检测转染miR-223时的表达情况结果显示，miR-223 mimics组miR-223的相对表达明显高于NC mimic组(4.290±1.307vs.1.020±0.042)，差 异 有 统 计 学 意 义(t=4.337，P=0.049，图2)。

图2 Real-time PCR检测siha细胞miR-223的相对表达Fig.2 The relative expression level of miR-223 in siha cells by Real-time PCR

2.3 miR-223靶向调控ARMCX1用TargetScan生物信息学软件进行预测的结果显示，miR-223与ARMCX1 3’UTR存在互补结合位点，提示ARMCX1是miR-223的靶基因（图3A）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC mimic+WT组相比，miR-223 mimics+WT组的荧光素酶活性(1.01±0.04vs.0.460±0.142)明显降低，差异有统计学意义(t=−6.457，P=0.016)，而NC mimic＋MUT组 与miR-223 mimics+MUT组的荧光素酶活性(1.03±0.67vs.0.720±0.489)差异无统计学意义(t=1.100，P=0.382，图3B）。提示miR-223可靶向作用于ARMCX1。

过 表 达miR-223时，Real-time PCR和Western blotting检测结果显示，miR-223 mimics组细胞中ARMCX1 mRNA及其蛋白表达为（0.440±0.067）、（0.300±0.086），均低于NC mimic组的（1.00±0.04）、（0.680±0.105），差异有统计学意义(t=−12.824，P=0.001；t=−4.792，P=0.010，图3C、3D）。说明miR-223能直接靶向调控ARMCX1的表达。

图3 miR-223靶向调控ARMCX1Fig.3 miR-223 targeted ARMCX1

2.4 转染miR-223对宫颈癌细胞增殖及侵袭能力的影响CCK8结果显示，与NC mimic组相比，miR-223 mimics组细胞在48、72 h增殖能力受到明显抑制，差异有统计学意义(t=−5.353，P=0.006；t=−3.754，P=0.020，图4）。

图4 CCK8检测过表达miR-223的siha细胞增殖能力Fig.4 The proliferation ability of miR-223 overexpressed in siha cells detected by CCK8

Transwell实验结果显示，与NC mimic组相比，miR-223 mimics组细胞穿膜数量（57.330±10.408vs.25.670±4.041）明显减少，差异有统计学意义（t=−4.912，P=0.008，图5）。

图5 Transwell检测过表达miR-223 siha细胞侵袭能力Fig.5 The invasion ability of miR-223 overexpressed in siha cells by Transwell

2.5 转染GV230-ARMCX1及miR-223 mimics对宫颈癌细胞增殖及侵袭能力的影响CCK8检测结果显示，miR-223+GV230-ARMCX组细胞增殖能力在24、48、72 h较miR-223+GV230-NC组明显升高，差异有统计学意义(t=3.379，P=0.028；t=−3.895，P=0.018；t=3.153，P=0.034，图6）。

图6 CCK8检测转染GV230-ARMCX1及miR-223 mimics组siha细胞的增殖能力Fig.6 The proliferation ability of GV230-ARMCX1 and miR-223 mimics in siha cells detected by CCK8

Transwell实 验 结 果 显 示，miR-223＋GV230-ARMCX组 细 胞 穿 膜 数 为(64.00±7.937)，较miR-223+GV230-NC组的(41.67±7.638)明显增多，差异有统计学意义(t=−3.512，P=0.025，图7）。

3 讨 论

miRNA作为一类短链非编码RNA，在人类多种恶性肿瘤中发挥癌基因/抑癌基因的作用，调控肿瘤细胞的各种生物学过程[11-12]。文献报道，miR-223在胃癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中低表达[13-15]，但在结直肠癌却高表达[16]。因此，miR-223在不同的肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的作用。在本研究中，miR-223在宫颈癌组织中的表达低于癌旁组织，推测miR-223在宫颈癌中可能发挥抑癌基因的作用。进一步在宫颈癌siha细胞中转染miR-223 mimic，结果发现宫颈癌siha细胞中miR-223的表达明显升高，且细胞增殖和侵袭能力受到抑制，说明过表达miR-223能够抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力，在宫颈癌中作为抑癌基因发挥作用。

miRNA在人类肿瘤中主要通过与靶基因mRNA结合，以转录后调控的方式抑制靶基因的表达或使靶基因降解，在细胞的分化、增殖、侵袭和凋亡等生物过程中发挥作用。研究发现，miR-223在胃癌中通过靶向调控Sp1基因表达来抑制胃癌细胞上皮间质化的发生[13]。在乳腺癌中miR-223能够靶向调控FOXO-1的表达来促进乳腺癌细胞的增殖[15]。miR-223也可以靶向作用PDS5B来影响胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力[17]。说明miR-223能够通过调控多种靶基因参与多种肿瘤细胞的生物学行为。因此，我们猜测miR-223是否也能通过调控特定靶基因抑制宫颈癌细胞的增殖与侵袭能力。Targetscan等多种生物信息学软件预测结果显示，ARMCX1为miR-223的靶基因，进一步研究发现过表达miR-223的siha细胞中ARMCX1 mRNA和蛋白表达均呈低表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-223能够有效抑制荧光素酶的表达，进一步证实miR-223能够特异性地结合ARMCX1，ARMCX1为miR-223的靶基因。

ARMCX1位于Xq21.33-q22.2，是由一个外显子编码，具有两个arm repeat结构的Arm蛋白家族的成员之一[18]。文献报道，ARMCX1在多种肿瘤组织中呈现低表达，而在宫颈癌组织中呈高表达水平[19-20,3]。我们前期研究显示，在宫颈癌siha细胞中沉默ARM⁃CX1后引起细胞周期S期阻滞，抑制siha细胞增殖。究其原因是沉默ARMCX1引起细胞周期相关蛋白cyclin E和cdc25A表达量下调[4]。本研究Real-time PCR结果显示，ARMCX1 mRNA在宫颈癌组织中表达量明显高于癌旁组织。而miR-223在宫颈癌组织中的表达水平低于癌旁组织。过表达miR-223的siha细胞中ARMCX1mRNA和蛋白表达显著下调。miR-223可以直接与ARMCX1 3'-UTR结合。另外，在过表达miR-223的siha细胞中转染GV230-ARMCX1，结果显示，其可逆转过表达miR-223导致的对宫颈癌细胞增殖和侵袭能力的抑制。以上结果均表明，miR-223通过负调控ARMCX1影响宫颈癌细胞的增殖和侵袭。

综上分析，miR-223在宫颈癌细胞中低表达，扮演抑癌基因的角色。miR-223通过靶向调控ARM⁃CX1抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。本研究为进一步探讨miR-223在宫颈癌发生发展过程中的分子机制提供理论基础。但本研究也存在不足，收集的临床标本数量相对较少，可能对研究结果产生偏倚。在后续研究中需要收集更多临床样本，以完善实验数据。