外源性H2S对氧糖剥夺再灌注后SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

吴昌学，董艳军，黄 赟，肖子宇，李 毅，齐晓岚，官志忠，肖 雁

（1.地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004；2.贵州省人民医院，贵州贵阳 550004）

血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是目前最常见的老年痴呆病之一，为缺血性、低灌注、出血性脑损伤等一系列心脑血管疾病导致的智能及认知功能障碍综合征，相较于阿尔茨海默病发病机制的复杂性及临床特点的不可逆性，其具有可逆性，故被称为“可逆性痴呆”[1]。主要表现为认知功能的缺失或损伤，同时伴有语言、运动、空间及人格等方面的问题。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）作为新型气体信号分子，其在体内主要以HS—形式存在。有学者的研究结果提示，H2S与神经系统及心脑血管疾病相关，H2S能增强中枢神经系统中海马的长时程记忆及调控大脑细胞内的Ca2+浓度及pH水平[2-3]。虽然H2S对神经系统的生理功能的研究倍受关注，但是其对脑缺血的作用机制尚不明确。人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）是一种低分化的肿瘤细胞，显示中等水平的多巴胺-β-羟基酶活性，细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似，有明显的轴突。因其具有分化程度低、增殖快及形态稳定等特点，常被用于神经系统疾病的相关研究[4-5]。因此，本研究以氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后的SH-SY5Y细胞作为神经细胞的体外缺血再灌注损伤模型，探讨H2S对神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器NaHS购自Sigma公司（美国），牛血清、DMEM培养基、2.5 mL/L胰蛋白酶液及10×PBS均购自HyClone公司，二甲亚砜(DMSO)购自Gibco公司。Tris碱、甘氨酸PMSF、SDS、Tween-20、RIPA裂解液（强）购自碧云天生物有限公司。5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自北京鼎国生物技术有限公司，显影胶片购自Amersham公司（美国），蛋白Marker购自GeneTex公司，PVDF膜和ECL试剂购自美国Millipore公司。细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI）购自上海贝博生物公司，anti-β-actin、GRP78、CHOP一抗购自Abcam公司（美国），anti-NFκBp65、COX一抗购自CST公司（美国），通用二抗购自Abmart公司。流式细 胞仪(美国BD公司)，ELX 800 UV酶 标仪(美国Bio-Tec公 司)，Western blotting跑 胶装置(北京百晶生物技术有限公司)。实验细胞采用SH-SY5Y细胞株，为本课题组稳定保存。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养SH-SY5Y细胞培养方法参考文献[6]，常规培养方法复苏细胞，用DMEM高糖培养基（含100 mL/L胎牛血清）稀释细胞后置37℃、50 mL/L CO2恒温培养箱培养。2~3 d传代1次，取对数生长期细胞进行研究。

1.2.2OGD/R模型的制备使用课题组的常用方法[6]建立OGD/R模型：根据前期课题组氧糖剥夺各个时间的细胞毒性实验结果，最终选取氧糖剥夺12 h再恢复正常培养24 h来进行实验。取对数生长期细胞，消化分离，计数细胞后制成密度为1×108/L的细胞悬液，按接种于96孔板（100 μL/孔），37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养20 h。OGD/R组细胞用37℃预热的PBS清洗2次（去含血清的高糖DMEM培养基）后加入不含血清的低糖DMEM培养基，置于三气培养箱中分别培养，气体条件为37℃、930 mL/L N2、20 mL/L、50 mL/L CO2。培养12 h后换正常培养液，置于37℃50 mL/L培养箱内再培养24 h。

1.2.3NaHS对SH-SY5Y细胞的毒性作用NaHS组缺氧处理与OGD/R组相同，只是在恢复正常培养的同时分别给予终浓度为0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.5、4.0 mmol/L的NaHS溶液 处理细 胞；对照（Control）组仅在37℃50 mL/L CO2培养箱内培养，不作OGD处理。各组细胞在进行相应处理后，均置于37℃50 mL/L CO2培养箱内培养12 h，随后在各孔内加入CCK-8试剂10 μL，再置 于37℃50 mL/L CO2培养箱内培养2 h，检测各孔吸光度(OD)值，计算细胞存活率[6]。每组均设置6个复孔，实验重复3次。根据活性检测结果最终选取0.2、0.4、4.0 mmol/L 3个浓度为后续NaHS处理组。

1.2.4OGD/R 12 h后细胞的凋亡水平采用流式细胞仪检测。取OGD处理后的各组细胞，用预冷的PBS洗涤 细 胞2次，用1×Binding Buffer悬浮 并 稀 释细胞浓度为1×109个/L，加入Annexin V-FITC 3 μL，轻悬后4℃避光孵育15 min。加入PI 10 μL，4℃避光孵育5 min[6]。

1.2.5内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)、CCAAT/增 强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologous protein,CHOP)及NF-κBP65、COX-2的蛋白表达采用Western blotting法检测。用蛋白裂解液裂解细胞，4℃温度下12 000 r/min离心30 min，取上清液测定总蛋白质浓度，并调整各组蛋白浓度到同一水平并上样，然后电泳、转PVDF膜、一抗4℃孵育过夜、二抗后孵育、ECL1显色剂、曝光，扫描各免疫印记条带后，采用Image J软件对图像进行分析。

1.3 统计学处理本研究所有数据采用SPSS 16.0统计学软件分析，如数据符合正态分布的计量资料，则采用(±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 OGD/R 12 h/24 h后各组细胞的存活率SHSY5Y细胞氧糖剥夺12 h后正常培养24 h，OGD/R模型组细胞活性Control组显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与OGD/R模型组比较，NaHS浓度为0~1.0 mol/L时，细胞增殖活性升高，NaHS浓度大于2.5mmol/L时，细胞活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 NaHS处理对OGD/R介导的细胞存活的影响Fig.1 The effect of NaHS on OGD/R-mediated SH-SY5Y viability

2.2 OGD/R 12 h/24 h后各组细胞的凋亡水平SH-SY5Y细胞氧糖剥夺12 h后正常培养24 h，图2的流式细胞图显示，Control组细胞主要分布在左下象限为活细胞，而OGD/R模型组细胞在右上象限（为晚期凋亡细胞）和右下象限（为早期凋亡细胞）均有明显增加，提示OGD/R模型组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞增加。统计结果显示，各组细胞处理12 h时，OGD/R模型组细胞的凋亡水平显著高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与OGD/R模型组比较，0.4 mmol/L浓度的NaHS处理组细胞的凋亡水平显著降低，而4 mmol/L NaHS浓度处理组细胞的凋亡水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 NaHS处理对OGD/R后细胞凋亡水平的影响Fig.2 The effect of NaHS on OGD/R-mediated cellular apoptosis in SH-SY5Y

2.3 各组OGD/R 12 h复氧24 h后细胞的内质网应激相关蛋白GRP78及CHOP的蛋白表达SH-SY5Y细胞氧糖剥夺12 h后正常培养24 h，由OGD/R后细胞的GRP78及CHOP蛋白表达均显著高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.01）；用0.2、0.4、4 mmol/L浓度NaHS处 理 后，与OGD/R模 型 组比较，GRP78及CHOP蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；但不同剂量组间差异无统计学意义（图3）。

图3 NaHS处理对SH-SY5Y细胞OGD/R后GRP78及CHOP的蛋白表达Fig.3 The effect of NaHS on OGD/R-mediated expression levels of GRP78 and CHOP in SH-SY5Y

2.4 各组细胞OGD/R 12 h复氧24 h后细胞的NF-κBp65及COX-2的蛋白表达各组细胞处理12 h时，OGD/R模 型组细胞 的NF-κBp65表达水 平均显著高于Control组、COX-2蛋白表达水平均显著高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与OGD/R模型组比较，0.2、0.4、4 mmol/L浓度NaHS处理组细胞的NF-κBp65表达水平显著降低，差异有统 计 学 意 义（P＜0.05）；0.2、0.4 mmol/L细 胞 的COX-2的蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图4)。

图4 NaHS处理对SH-SY5Y细胞OGD/R后NF-κBp65及COX-2的蛋白表达Fig.4 The effect of NaHS on OGD/R-mediated expression levels of NF-κBp65and COX-2 in SH-SY5Y

3 讨 论

随着人口老龄化的加剧，VaD发病率也呈逐年上升趋势[7]。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是目前临床上高致残率、高致死率的主要疾病之一[8]，也是引起VaD的主要因素之一。新型气体信号分子H2S具有重要的生物学功能，其对神经系统的生理功能研究受到广泛关注。WANG等[9]发现，在局灶脑缺血-再灌注后，H2S能保护血脑屏障的完整性。外源性H2S能通过多种机制防止大鼠全脑的缺血-再灌注损伤[10]。本研究对SH-SY5Y模拟体外脑缺血OGD/R后，流式细胞术检测细胞存活率检测结果显示，OGD/R模型组细胞的存活率明显低于对照组，当OGD/R发生时，早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞数明显增多，提示SH-SY5Y细胞凋亡率明显增高，说明对细胞进行OGD/R处理后可明显诱发SH-SY5Y细胞的凋亡，而H2S能减轻OGD/R引起的细胞凋亡。

为进一步探讨OGD/R后神经元的损伤机制及H2S的保护机制，本研究对内质网应激和细胞凋亡的信号通路进行研究。在脑缺血后，低能量水平可以破坏内质网中正常蛋白质折叠，导致未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)和内质网应激(endo⁃plasmic reticulum stress,ERS)的激活[11]，GRP78作 为抗凋亡标志物在UPR发生后表达增加，促进内质网稳态、细胞结构及功能的恢复，在缺血再灌注损伤过程中引起ERS的刺激持续存在，ERS过强，细胞结构及功能无法恢复，引起细胞凋亡[12]。CHOP作为促凋亡转录因子，是介导ERS导致的细胞凋亡中至关重要的蛋白之一，通过对GRP78和CHOP表达水平的分析可以判断ERS的激活状态。本研究发现，OGD/R后GRP78及CHOP表达均较对照组显著增高，说明氧糖剥夺再复氧损伤进一步促进了ERS的激活。对氧糖剥夺再复氧神经细胞用不同浓度NaHS处理后，低剂量0.2 mmol/L处理组GRP78及CHOP的表达均较对照组显著降低，说明低剂量NaHS抑制了ERS的激活。

越来越多的研究发现，ERS与NF-κB高度相关，内质网应激后，内质网腔内大量未折叠和（或）错误折叠的蛋白质生成增加，可竞争结合GRP78，促进IRE1α活化，进一步激活IκB的上游激酶IKK，使IkB磷酸化后与NF-κB解离，游离NF-κB的亚基p65迅速移位到细胞核，在核内磷酸化为P-p65，与特异性κB序列结合，诱导炎症相关基因的转录，促进炎症介质的表达[13]。作为NF-κB下游靶基因，iNOS与COX-2在脑缺血状态下迅速被诱导表达，损伤细胞的DNA和蛋白质[6,14]。COX-2为诱生型环氧化酶，在神经系统炎症中起着重要作用[6,15]。静息状态下，COX-2表达较少，但是在脑缺血后，神经元表达COX-2和iNOS，作为炎症因子参与炎症反应同时激活小胶质细胞产生大量活性氧(active oxygen,ROS)，细胞受ROS刺激，启动线粒体凋亡途径，破坏线粒体膜的通透性，造成线粒体功能紊乱，导致细胞能量代谢障碍及钙超载[19,16-17]，引起细胞凋亡，加重脑缺血损伤。本研究结果表明，SH-SY5Y细胞GOD/R后引起内质网应激激活NF-κB，进而激活了下游炎症基因COX-2；课题组前期研究显示，低剂量H2S可以下调VaD大鼠海马组织COX-2、NF-κB的表达，改善VaD大鼠的学习记忆能力[18-19]。提示氧糖剥夺再灌注损伤可能是通过ERS激活诱导NF-κB/COX-2通路导致细胞凋亡。TAO等[20]通过大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型研究表明，在MCAO前24 h，用低浓度的NaHS预处理实验小鼠后，可抑制NF-κB的激活，从而减少炎症发生，改善小鼠行为，这与课题组前期动物实验结果相同。

本研究还发现低剂量H2S对神经细胞具有明显的保护作用，而高剂量H2S对细胞的保护作用不确定。REN等[21]用180 μmol/kg的 硫 氢 化 钠(NaHS)预处理全脑缺血再灌注（global cerebral ischemia/reper⁃fusion,GCIR）模型大鼠后，加重了GCIR导致的神经元损伤，而25 μmol/kg的NaHS则减轻了神经元损伤。该研究提示，低浓度外源性的H2S可能对GCIR所致神经元损伤具有保护作用，与本研究的结果一致。以上均说明，低浓度的H2S在改善GCIR中起重要作用。由此可见，在GCIR中给予外源性H2S对脑组织具有双向效应。这可能与给予的NaHS剂量在体内产生H2S的量和自身内源性H2S的表达调节能力有关[22]。

综上所述，在OGD/R模型细胞模拟的体外缺血-再灌注损伤后，低浓度NaHS处理OGD/R模型细胞后，可以提高经OGD/R模型细胞的细胞活性，抑制缺氧-再灌注对神经元的损伤。这可能与其减轻ERS、降低NF-κBp65、COX-2的蛋白表达，减轻炎性反应以及下调细胞凋亡水平有关，进而达到保护神经元的目的。