HBx蛋白抑制滋养细胞凋亡的作用及机制

潘怡霞，林亚云，刘 妍，郭凡凡，张文涛，白桂芹

（1.西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西西安 710061；2.昆明医科大学第一附属医院生殖遗传科，云南昆明 650032；3.解放军总医院第五医学中心，临床研究管理中心，北京 100039；4.西安市第三医院妇产科，陕西西安 710016）

中国是乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染的高发地带，人群HBV携带率为9.9%，HBV感染与慢性肝炎、肝硬化和肝癌密切相关[1-3]。HBV母婴传播包括宫内感染、分娩过程中的感染和分娩后的感染[4]。从母亲到婴儿的后两种传播途径可通过在婴儿出生后立即使用HBV疫苗和HBV免疫球蛋白（hepatitis B immunoglobulin,HBIG）治疗而阻断[5]。但仍然有5%~10%的婴儿未能阻断HBV感染，这主要是发生宫内感染所致[6-9]。本课题组前期的研究发现HBV可通过母体血液接触胎盘并感染胎盘滋养细胞，产生乙肝X蛋白（hepatitis B X protein,HBx），与胞内磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶（protein ki⁃nase B,Akt）抑制滋养细胞凋亡的信号通路有关[10-11]。本研究将进一步明确HBx蛋白通过内皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）/PI3K/Akt信号通路抑制胎盘滋养细胞凋亡的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料人绒毛膜癌细胞株JEG-3（中科院上海生命科学研究院细胞库），人滋养细胞HTR-8（第四军医大学唐都医院妇产科实验室），DMEM高糖培养、RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；优质胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（Amresco公司）。EGFR过表达慢病毒颗粒（复能基因），EGFR shRNA（维真生物），pGL3-EGFR启动子荧光素酶表达质粒（上海宇玫博生物），pGL3-basic、pGL3-control、pRLTK质粒（Promega公司），pGFP-HBx表达质粒（Add⁃gene）；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司、德国QIAGEN公司）；0.22 μm滤器（Millpore公司）；转染试剂X-tremeGENE HD（德国Roche公司）。兔抗人HBx多克隆抗体、兔抗人EGFR多克隆抗体（Abcam公司），兔抗人PI3K单克隆抗体、兔抗人p-Akt单克隆抗体、兔抗人Akt单克隆抗体（Cell Signaling公司）；化学发光底物（Thermo公司）；辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG、兔抗β-actin多克隆抗体、鼠抗β-actin多克隆抗体（北京康为世纪生物公司）；羊抗兔IgG-Cy3（康维世纪）。8孔腔室载玻片（ibidi），细胞凋亡试剂盒（凯基生物）。pGFP-HBx质粒、野生型pTriEx-1.1 HBV质粒和HBx缺失突变型pTriEx-1.1 HBV质粒为本课题组前期构建提取储存。

1.2 细胞培养将JEG-3及HTR-8细胞从液氮中取出复苏后，JEG-3细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中，HTR-8细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于含50 mL/L CO2、37℃恒温细胞培养箱中孵育。将复苏成功的细胞培养传2代后进行后续实验。

1.3 双荧光素酶检测HBx与EGFR启动子的关系分别将正常培养的JEG-3、HTR-8细胞以3×105/孔接 种 至24孔板，16~18 h时将pGL3-EGFR启动子荧光素酶表达载体与内参pRL-TK载体按30∶1的比例分别共转染2种细胞。每种细胞各分为3组。实验组（HBx+E组）共转染pGFP-HBx表达质粒和pGL3-EGFR启动子荧光素酶表达载体；空载体对照组（Control组）共转染pGFP空载体和pGL3-EGFR启动子荧光素酶表达载体；阴性对照组（NC组）共转染pGFP-HBx表达质粒和pGL3-Basic荧光素酶表达载体。设置pGL3-Basic荧光素酶报告载体为阴性对照，pGL3-Control荧光素酶报告载体为阳性对照。48 h时进行各组细胞荧光素酶活性检测，分析HBx对EGFR启动子活性的影响。

1.4 EGFR过表达或敲低的JEG-3、HTR-8细胞系的构建及实验分组通过慢病毒颗粒感染细胞构建EGFR稳定表达细胞系：培养JEG-3、HTR-8细胞至对数生长期，每孔9.5×104个细胞于500 μL相应细胞培养液至24孔板，过夜培养后更换完全培养液，分别加入相应的慢病毒颗粒液，即慢病毒量（mL）=接触慢病毒的细胞数×MOI/慢病毒滴度（TU/mL）。感染12~16 h后，吸弃含慢病毒颗粒的培养液，加完全培养液继续培养72~96 h，观察荧光表达。于感染72 h时加入嘌呤霉素2 μg/mL药物筛选。将稳定过表达EGFR的JEG-3、HTR-8细胞系定义为EGFR过表达组。

通过脂质体法转染细胞构建敲低EGFR表达细胞系：稳定过表达EGFR的JEG-3、HTR-8细胞培养至对数生长期，按每孔约1.0×106个细胞接种于6孔板中，培养至50%~60%汇合时采用脂质体转染法转染EGFR shRNA。将2 μg质粒 和4 μL转 染试剂X-tremeGENE HP混匀后室温孵育30 min，加入细胞培养孔，摇匀后继续培养72 h，显微镜下观察细胞形态。将干扰EGFR表达的JEG-3、HTR-8细胞系定义为EGFR敲低组。本研究另设空白对照组，细胞未进行处理。

1.5 Western blotting检测EGFR/PI3K/p-Akt的表达分别收集1.4项各组细胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min。4℃12 500 r/min离心25 min，离心后保留上清，用BCA法测定蛋白浓度，计算蛋白上样量。用SDS-PAGE电泳法进行蛋白电泳后通过转膜仪移至硝酸纤维素膜上；将膜置于含50 g/L脱脂奶粉的TBST中进行抗体封闭2 h，随后分别于一抗（兔抗人EGFR多克隆抗体1∶1 000，兔抗人PI3K单克隆抗体、兔抗人p-Akt单克隆抗体1∶500，兔抗人Akt单克隆抗体1∶800，鼠抗β-actin多克隆抗体1∶1 000）及HRP标记的二抗（辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG均为1∶2 000）孵育后，ECL发光液显色，压片保存。

1.6 激光共聚焦成像分析EGFR/PI3K/p-Akt蛋白定位表达分别收集1.4项各组细胞，按每孔4.5×104个细胞接种到8孔腔室载玻片。48 h后细胞生长至约90%，弃上清，用1×PBS清洗细胞，40 g/L多聚甲醛 固 定，1 mL/L Triton X-100破 膜，30 g/L BSA室温封闭2 h。一抗（兔抗人EGFR多克隆抗体1∶500，兔抗人PI3K单克隆抗体、兔抗人p-Akt单克隆抗体1∶250）4℃孵育过夜，二抗（羊抗兔IgG-Cy3 1∶500）37℃避光孵育40 min，加细胞核染液DAPI染核10 min，PBS再次清洗 后，在Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察并分析结果。

1.7 Western blotting检测HBx、PI3K/p-Akt的表达在6孔板内培养JEG-3、HTR-8细胞，每种细胞分为4组，分别转染pGFP-HBx质粒、野生型pTriEx-1.1 HBV质 粒、HBx缺 失 突 变 型pTriEx-1.1 HBV质粒和pGFP空载体。培养72 h，收集各组细胞进行Western blotting检测，具体步骤同1.6项（兔抗人HBx多克隆抗体1∶500）。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡收集1.4项各组细胞接种于12孔板培养72 h，分别用不含EDTA的胰酶消化，PBS洗涤细胞2次（2 000 r/min离心5 min）收集（1~5）×105细胞；加入500 μL的Binding Buffer悬浮 细 胞；加 入5 μL Annexin V-FITC混 匀 后，加 入5 μL PI（propidium iodide），混匀；室温、避光反应5~15 min；在1 h内使用流式细胞仪检测。将1.7项中的各组转染细胞培养48 h，分别用不含EDTA的胰酶消化收集，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.9 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件对资料进行统计学分析；实验数据以“均数±标准差”表示，2组样本比较采用独立样本t检验，多组样本比较采用单因素或双因素方差分析，组间多重比较采用Bonferroni多重比较法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 双荧光素酶报告基因检测HBx与EGFR启动子的关系结果显示，同时转染HBx质粒和pGL3-EGFR启动子荧光素酶表达载体的实验组（HBx+E组）JEG-3和HTR-8细胞中，pGL3-EGFR启动子荧光素酶表达较空载体对照组（Control）及阴性对照组（NC组）均显著增高（均为P＜0.01，图1）。

图1双荧光素酶报告基因检测HBx与EGFR启动子的关系Fig.1 Relationship between HBx and EGFR promoters de⁃tected by luciferase reporter assay

2.2 EGFR过表达时EGFR/PI3K/p-Akt蛋白的表达情况

2.2.1各组EGFR/PI3K/p-Akt蛋白的表达West⁃ern blotting结果显示，EGFR过表达组的2种细胞中EGFR蛋白表达高于空白对照组（JEG-3细胞，HTR-8细胞，均为P＜0.05）；EGFR敲低组的2种细胞内EGFR表达显著低于EGFR过表达组（均为P＜0.01），说明EGFR过表达组及EGFR敲低组细胞构建成功。EGFR过表达组的2种细胞内PI3K及p-Akt的蛋白表达显著高于空白对照组和EGFR敲低组（均为P＜0.01）；各组之间Akt表达差异无统计学意义（图2）。

图2 Western blotting检测细胞内EGFR/PI3K/p-Akt蛋白表达Fig.2 Expression of EGFR/PI3K/p-Akt protein detected by Western blotting

2.2.2各组细胞内EGFR/PI3K/p-Akt蛋白表达定位激光共聚焦成像结果显示（图3）：EGFR过表达组的EGFR蛋白表达高于空白对照组与EGFR敲低组（均为P＜0.05）；当EGFR过表达组细胞转染shRNA而敲低表达后，EGFR敲低组的两组细胞内EGFR表达较EGFR过表达组降低（均为P＜0.05）。当EGFR过表达时，两组细胞内PI3K/p-Akt表达高于空白对照组和EGFR敲低组（均为P＜0.05），表达变化与Western blotting结果一致。

图3激光共聚焦成像分析EGFR/PI3K/p-Akt蛋白表达定位Fig.3 Localization and expression of EGFR/PI3K/P-Akt protein by laser confocal imaging(×400)

2.3 EGFR/PI3K/p-Akt信号通路抑制细胞凋亡流式细胞术结果显示：EGFR过表达组2种细胞的凋亡比例较空白对照组显著降低（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01）；EGFR敲低组2种细胞的凋亡比例显著高于EGFR过表达组（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01，图4）。这说明胎盘滋养细胞凋亡比例与EGFR/PI3K/p-Akt表达呈负相关。

图4 流式细胞术检测EGFR/PI3K/p-Akt信号通路抑制细胞凋亡Fig.4 The inhibitory effect of EGFR/PI3K/p-Akt signaling pathway on apoptosis detected by flow cytometry

2.4 HBx蛋白促进PI3K/p-Akt信号通路蛋白表达当JEG-3、HTR-8两种细胞转染pGFP-HBx质粒及pTriEx-1.1 HBV野生型质粒时，可检测到HBx蛋白表达；转染HBx缺失突变型pTriEx-1.1 HBV质粒组和空载体对照组无HBx蛋白表达；当存在HBx蛋白表达时，即转染pGFP-HBx质粒组和转染pTriEx-1.1 HBV野生型质粒组中PI3K及p-Akt蛋白表达显著高于HBx缺失组和空载体对照组（均为P＜0.05）；各组之间Akt表达差异无统计学意义（图5）。

图5 Western blotting检测HBx及PI3K/p-Akt蛋白表达情况Fig.5 Expressions of HBx and PI3K/p-Akt protein detected by Western blotting

2.5 HBx蛋白抑制细胞凋亡流式细胞术结果显示，JEG-3和HTR-8两种细胞转 染pGFP-HBx组 及转染pTriEx-1.1 HBV组细胞凋亡率均较转染HBx缺失突变pTriEx-1.1 HBV组及空载体对照组显著降低（均为P＜0.05，图6）。这提示绒毛膜癌滋养细胞凋亡比例与HBx/PI3K/p-Akt表达呈负相关。

3 讨 论

HBx可整合入EGFR等调控细胞生长基因，影响细胞内信号转导[12]。研究表明，HBx可影响EGFR和EGFR家族其他成员的激活[13-14]，将不同的信号刺激传入细胞内，从而启动了信号转导级联而产生多种生化反应。而HBx激活EGFR的作用位点及机制还有待进一步研究。

本研究通过双荧光素酶活性检测，发现HBx质粒与EGFR启动子质粒共转染时，EGFR启动子表达显著高于空载体对照组及阴性对照组（P＜0.01）。本研究首次发现并证实HBx蛋白可作用于EGFR启动子区域，激活EGFR启动子表达。

图6流式细胞术检测HBx蛋白对细胞凋亡的抑制作用Fig.6 The inhibition of HBx protein on apoptosis detected by flow cytometry

EGFR在哺乳动物细胞表面广泛分布，作为膜表面受体，具有酪氨酸激酶活性，可将不同的信号刺激传入细胞内，激活多种下游信号途径如PI3K/p-Akt/Bad、Ras/Raf/MEK/ERK等多种信号转导途径，与刺激细胞增殖、细胞移动性增强及器官的修复有密切关系[15]。EGFR/PI3K/p-Akt在许多类型细胞的增殖调控和凋亡抑制中发挥关键作用[16-17]。

为探讨在胎盘滋养细胞内EGFR/PI3K/p-Akt信号通路的调控机制与HBV宫内感染之间存在的内在关系，本研究构建了EGFR过表达滋养细胞，使用shRNA敲低过表达组EGFR表达，通过Western blotting及激光共聚焦检测EGFR/PI3K/p-Akt表达及定位。EGFR/PI3K/p-Akt均位于细胞质中，当EGFR过表达时PI3K/p-Akt表达显著升高（P＜0.01），Akt表达无统计学差异，细胞凋亡比例显著降低（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01）。EGFR过表达组被敲低后，PI3K/p-Akt表达显著降低（P＜0.01），Akt表达无统计学差异，细胞凋亡比例显著增加（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01）。胎盘滋养细胞内EGFR过表达时可以激活其下游信号通路PI3K/p-Akt，并通过PI3K/p-Akt信号通路抑制胎盘滋养细胞凋亡，证实EGFR激活PI3K/p-Akt从而抑制胎盘滋养细胞凋亡，使感染HBV的滋养细胞寿命延长，逃避机体免疫系统的清除。HBV DNA得以大量复制合成，增加HBV宫内感染的危险性。

有研究表明，体外和体内的高复制状态下（HBV DNA＞1×103copies/mL），尤其是HBV DNA＞1×107copies/mL，滋养细胞内有HBxAg的表达，滋养细胞凋亡明显受到抑制，同时细胞内PI3K及p-Akt的表达上调。在妊娠过程中,孕妇血液内的HBV感染胎盘滋养细胞后，在其中复制繁殖，抑制滋养细胞凋亡，可能与产生的HBx蛋白及胞内PI3K/p-Akt信号通路有关[10-11]。WANG等[18]的研究发现,pEGFR蛋白在HBx感染的人胎盘组织和滋养细胞中明显上调，HBx通过激活EGFR/Akt通路，减少细胞凋亡，促进胎盘滋养细胞分泌胎盘激素。本研究发现，当胎盘滋养细胞内存在HBx蛋白表达时，PI3K/p-Akt表达显著升高(P＜0.05)，细胞凋亡率则显著降低(P＜0.05)。这证实了HBx蛋白通过促进EGFR/PI3K/p-Akt信号通路，抑制胎盘滋养细胞凋亡，与已有研究报道的结果一致[19-20]。

综上所述，在胎盘滋养细胞内HBx蛋白作用于EGFR启动子区域，通过调控EGFR启动子区激活EGFR及其下游信号通路PI3K/p-Akt，抑制细胞凋亡，受HBV感染的胎盘滋养细胞生存期延长，有益于HBV DNA的复制，为病毒提供了潜伏场所，实现免疫逃逸。因此，探讨HBx蛋白在HBV宫内感染中的作用及机制是未来研究的重点。