响应面分析法优化超临界萃取烟末中的茄尼醇

丁润波,马 斌,花 蕾,郭 磊,杜青霞

(甘肃烟草工业有限责任公司 技术研发中心，甘肃 兰州 730000)

茄尼醇是烟草中含有的多萜类化合物[1-2]，一种不饱和的聚异戊二烯醇，呈白色固体粉末，弱极性，有较高的药用价值，具有抗菌、消炎和止血等药理作用，也是合成辅酶Q10、维生素K2、抗癌增效剂SDB等的重要原料[3-4].目前茄尼醇萃取方法有溶剂萃取法、超临界CO2萃取法[5-6]、超声波辅助萃取[7]、微波萃取[8]、匀浆萃取、膜分离法等.高纯度茄尼醇的获取主要通过柱层析法、聚合态共沉淀法、大孔吸附树脂法等.超临界 CO2萃取技术是一种绿色、环保的新型高效分离技术,广泛应用于医药、食品、化工等领域，该工艺操作周期短、无溶剂残留，CO2无毒易得，较低的萃取温度对有效成分影响小.通过改变萃取条件或加入夹带剂能强化超临界流体的溶剂能力或选择性，提高目标产物萃取率，因此在天然产物萃取方面显示出明显的优势及广阔的应用前景[9-10].

我国是烟草生产大国，长期以来产生的烟末都没有得到重视，这不仅造成环境污染，而且浪费资源.本文采用响应面法优化超临界CO2萃取茄尼醇的萃取实验参数，更直观地探讨萃取条件以及夹带剂对萃取过程的影响及其交互效应，并结合柱色谱法对茄尼醇进一步纯化研究，旨在为茄尼醇高效萃取提供科学参考.

1 实验方法

1.1 仪器及试剂

超临界萃取装置SPEED SFE (美国 Applied Separations公司)；ESPEC电热恒温鼓风干燥箱 (日本爱斯佩克公司)；DFW-300C高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；梅特勒MS303TS(0.001 g)电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；Waters UPLC高效液相色谱仪(美国Waters公司)；工业级CO2气体(兰州裕隆气体股份有限公司)；ZF-6三用紫外线分析仪(上海金鹏分析仪器有限公司)；DL-720B超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);Heidolph旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)；闪式层析柱(欣维尔公司)；KL05A高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工厂)、硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)；95%乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚均为分析纯，甲醇，乙醇为色谱纯；茄尼醇标准品(Sigma-Aldrich公司).

1.2 原料及预处理

烟末粉碎后，过20目筛(粒径控制在20～40目)，所用设备要求不小于40目，否则有可能堵塞管路；加入超纯水浸泡并置于超声清洗器中(功率60 W，温度40 ℃)作用1 h，以减少其他成分如烟碱、蛋白质、尼古丁等对萃取物纯度的影响，抽滤并反复淋洗,滤渣加入饱和的醇钠溶液进行皂化反应，超声波清洗器(功率90 W，温度60 ℃)作用2 h，再用硫酸调节pH 至中性后抽滤，滤渣干燥后备用.

1.3 实验方法

本实验所用反应釜(萃取釜)规格为1 L.准确称取50 g处理后的烟末，置于1 L萃取釜中，按照文献报道夹带剂对萃取效果的影响[11]，固定95%的乙醇作为夹带剂，二氧化碳流量为2 L/min，在设定的温度和压力下进行超临界萃取，萃取时间固定为1.5 h.萃取结束后，从收集瓶中取出萃取物，用95%乙醇溶解,并定容至刻度,静置后移取200 μL至5 mL容量瓶,用95%乙醇定容至刻度.样品经0.225 μm微孔滤膜过滤,用高效液相色谱仪进行分析[12]，测定茄尼醇的萃取率.萃取率为萃取液中茄尼醇含量与烟叶中茄尼醇的含量的比值，本实验烟末中茄尼醇含量为0.641%.

高效液相色谱(HPLC)法分析条件如下：色谱柱：Symmetry C18柱 (250 mm×4．6 mm，5 μm )； 流动相：甲醇∶异丙醇 (45∶55)；柱温：30 ℃；流速：1.0 m L/min；进样量：20 μL.

1.4 响应面法优化实验

参照单因素实验结果[13-14]，根据影响超临界流体动态萃取的因素及参数范围，采用Minitab 16.0软件的 Box-Behnken模型进行实验设计及响应面分析.选取萃取压力(A)、萃取温度(B)、夹带剂流量(C)设计了三因素三水平的响应面实验，优化烟末中茄尼醇的超临界萃取条件.CO2流量对茄尼醇萃取率的影响研究相对较多，研究表明随着CO2流量的增加，萃取量逐渐增加并最终保持平稳；本研究设定了相对充足的萃取时间，以保证萃取物充分提取，因此选择了萃取压力、萃取温度和夹带剂流量3个因素.实验设计因素与水平见表1.

表1 Box-Behnken设计因素及水平

2 实验结果与讨论

2.1 Box-Behnken实验结果

优化过程选用三因素三水平展开，以茄尼醇萃取率作为响应值，共执行17组实验，结果见表2.

2.2 响应面模型方程的建立及显著性检验

利用Minitab 16.0 软件，对表2中茄尼醇萃取率进行多元回归拟合，获得茄尼醇萃取率对萃取压力(A)、萃取温度(B)和夹带剂流量(C)的二次多元回归方程：

表2 萃取优化实验方案及结果

Y=70.859-1.446×A-1.142×B-
2.185×C-14.911×A×B-2.712×A×C-
17.474×B×C+3.747×A2-
5.711×B2+ 1.332×C2.

方差分析结果如表3.

表3 方差分析结果

2.3 响应面模型交互作用分析

由各因素间的响应面图及等高线图可以直观的找到响应面的最高点，评价各因素交互作用对响应值的影响，以及确定各个因素的最佳水平范围.响应曲面越陡，说明两因素间交互作用就越强；若响应曲面的颜色越深，说明结果越显著.萃取压力和萃取温度交互作用的响应面及等高线如图1、图2.

图1、图2表明，夹带剂的流量设置为0.2 mL/min，萃取压力和萃取温度的交互作用对茄尼醇萃取率的影响，可知萃取压力约在20 MPa，萃取温度略低于55 ℃时，响应值达到最高点，萃取压力对萃取率的影响大于温度的影响.

图1 萃取压力和萃取温度交互作用的响应面

图2 萃取压力和萃取温度交互作用的等高线

萃取温度设置为53 ℃，萃取压力和夹带剂流量的交互作用对茄尼醇萃取率的影响如图3、图4所示.夹带剂流量约为0.2 mL/min，萃取压力在20 MPa附近时，响应值达到最高点，夹带剂流量对萃取率的影响大于萃取压力的影响.

图3 萃取压力和夹带剂流量交互作用的响应面

图4 萃取压力和夹带剂流量交互作用的等高线

萃取压力设置为25 MPa，萃取温度和夹带剂流量的交互作用对茄尼醇萃取率的影响图5、图6所示，夹带剂流量约为0.2 mL/min附近，萃取温度略高于50 ℃时，响应值达到最高点，夹带剂流量对萃取率的影响大于萃取温度的影响.综合来看，各因素对响应值的影响显著性表现为夹带剂流量>萃取压力>萃取温度.

图5 萃取温度和夹带剂流量交互作用的响应面

图6 萃取温度和夹带剂流量交互作用的等高线

可见，夹带剂流量的影响最为显著，随着夹带剂流量的升高，茄尼醇萃取率增加，当夹带剂流量继续增大时，茄尼醇萃取率则明显下降，表现为曲面较陡；萃取温度和萃取压力对萃取率的影响次之，响应面较缓和.

2.4 验证实验

用软件求得模型的最大预测值为71.47%，此时茄尼醇萃取实验的参数为萃取压力19.1 MPa，萃取温度为51.3 ℃，夹带剂流量为0.19 mL/min.为验证该模型的可靠性，考虑到实际可操作性，将萃取实验条件修正为萃取压力19 MPa，萃取温度51 ℃，夹带剂流量为0.2 mL/min，多次测量后实测值平均达到 69%.该值与数学模型优化得到的理论值相近，表示该模型对茄尼醇的萃取实验优化具有一定的实际价值.

2.5 纯化实验

称取一定量的萃取物，加石油醚溶解，湿法上样，缓慢加入层析柱，石油醚、乙酸乙酯为洗脱剂，通过硅胶柱层析予以纯化，薄层色谱监测(薄层条件∶石油醚∶乙酸乙酯=4∶1)，紫外分析仪显色.粗品中有大量与茄尼醇极性相似的蜡状物质，洗脱过程中先用石油醚冲洗，有助于分离蜡质.洗脱剂(石油醚∶乙酸乙酯)的极性的梯度从1∶100缓慢增加到1∶8，观察色带，待前两个黄色色带冲出后，试管收集洗脱液，点样并与标准品对照，合并相同组分.减压浓缩后，经高效液相分析，含量达到83%.蜡质与茄尼醇分离较好时，收集洗脱液在旋转蒸发仪浓缩后析出微黄色固体，分离不完全时，浓缩后易呈现淡黄色浆状物.

文献[15]报道了甲醇、乙腈及丙酮等溶剂都可以实现茄尼醇重结晶，其中甲醇的效果最好，综合分析后本研究采用甲醇与石油醚、乙腈、丙酮3种组合双溶剂进行重结晶，结果如表4.结果表明，用甲醇-丙酮双溶剂重结晶得到的茄尼醇效果最好，能将纯度提升至93.2%.

表4 混合溶剂茄尼醇重结晶效果

3 结论

研究了用超临界CO2萃取技术从烟末中萃取茄尼醇的实验条件，为了保证萃取物提取充分，设定了相对充足的萃取时间，因此选择了萃取压力、萃取温度和夹带剂流量3个影响因素.采用响应面优化萃取条件(萃取压力、萃取温度、夹带剂流量)，利用响应面法建立了以茄尼醇提取率为响应值的二次模型，该模型方差显著，失拟项不显著，决定系数高(R2=99.70%).实验结果表明，C提取的最佳实验条件为:萃取压力19 MPa，萃取温度53 ℃，夹带剂的用量为0.19 mL/min.通过验证实验发现，该参数条件下萃取茄尼醇萃取的真实值与理论值相近，具有一定的实际价值.优化后的过程具有周期短、提取效率高、粗提物黏稠性较低、杂质少等优势，有利于进一步上柱纯化和结晶，具有较好的应用前景.还研究了茄尼醇粗品的纯化方法，通过柱层析分离结合重结晶得到高纯度的茄尼醇，为后续的纯化工作提供一定的参考.