缝隙连接蛋白43在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中的动态表达及意义

王昕，刘向玲，苏绍波

(1.新乡医学院第三临床学院 眼科，河南 新乡 453003；2.新乡医学院，河南 新乡 453003)

视网膜新生血管增殖是早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)[1]、糖尿病视网膜病变[2]、新生血管性青光眼[3]等多种眼部血管性疾病发生发展的基础。氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型是研究视网膜新生血管形成及其转归最为常用的一种动物模型。缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)是连接蛋白家族中表达最广泛的亚型，在各种疾病动物模型中研究较多[4-7]。但目前尚无OIR小鼠视网膜Cx43表达变化的相关研究报道。本研究的主要目的是了解高氧诱导的OIR小鼠视网膜中Cx43在不同时期的表达水平，探讨Cx43与视网膜新生血管形成的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器山羊抗兔二抗(谷歌生物科技有限公司)；Cx43抗体、GAPDH抗体(英国Abcam公司)；Isolectin B4-594(Molecular Probes)；智能控氧仪(杭州艾普仪器设备有限公司)；Tanon发光成像仪(上海天能科技有限公司)；手术显微镜(日本尼康公司)；共聚焦显微镜(上海仁科生物有限公司)。

1.2 实验动物分组及取材选用北京维通利华实验动物技术有限公司提供的7 d龄C57BL/6N小鼠(批号SCXK2016-0006)80只，雌雄不限，体质量2.0～3.0 g，采用随机数表法将小鼠分为OIR组(40只)和正常对照组(40只)。OIR组小鼠用于建立OIR模型，对照组小鼠在正常空气环境下饲养，室温控制在(23±2)℃，同时每3 d更换1次垫料，保持氧舱干燥。分别于12 d龄(P12)、14 d龄(P14)、17 d龄(P17)和21 d龄(P21)随机抽取两组小鼠各10只(20眼)，CO2法处死并摘除眼球。3只(6眼)进行视网膜铺片观察视网膜新生血管增殖情况；剩余7只小鼠(14眼)取视网膜组织做Western blot，分析Cx43表达水平的变化。

1.3 OIR模型的建立OIR模型是按照Smith等[8]的描述制作的，即将哺乳母鼠与7 d龄C57BL/6N乳鼠放置于氧气体积分数为(75±2)%的氧箱中，隔日中午定时打开氧舱换食加水，并将正常环境饲养的哺乳母鼠与舱内母鼠进行互换。5 d后(即12 d龄)，小鼠突然回到室内正常空气环境中，建立小鼠OIR模型。

1.4 视网膜铺片将OIR组及正常对照组小鼠视网膜以视盘为中心剪为四叶草形状，将剪好的小鼠视网膜转移至事先配制好的IB4染液中，4 ℃摇床过夜。PBS清洗视网膜3次，每次10 min，再将视网膜转移至事先准备好的载玻片上，神经节细胞层朝上。滴一滴封片剂于视网膜上，盖上盖玻片，放置阴凉处数天后在共聚焦显微镜下观察血管分布及形态变化。

1.5 Western blot将剥离的小鼠视网膜组织放入RIPA蛋白裂解液中，冰上研磨、超声波破碎，然后转移至合适EP管，摇床晃动30 min。离心(12 000 r·min-1，4 ℃)10 min，留取上清，BCA法测定蛋白浓度，制样。将样品放入100 ℃金属浴中加热10 min后进行电泳，恒定电压80 V，约90 min；电泳完成后进行转膜(300 mA、90 min)，转膜时注意不要有气泡；将转好的PVDF膜放入含有50 g·L-1脱脂奶粉的TBST溶液，室温下轻摇封闭2 h；取出PVDF膜，分别加入抗Cx43多克隆抗体(1∶5 000稀释)与抗GAPDH单克隆抗体(1∶20 000稀释)，4 ℃孵育过夜。回收一抗孵育液，TBST溶液洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h。弃去二抗，TBST洗膜3次，每次10 min；使用Tanon成像系统显色并采集图像分析灰度值。

2 结果

2.1 视网膜铺片正常对照组：视网膜血管以视盘为中心放射状分布，呈均匀的网状结构，血管形态正常，走形清晰，见图1。OIR组：P12时视网膜中央可见大面积的血管闭塞区，毛细血管分布于视网膜周边，在血管闭塞区周围未见到新生血管簇；P14时血管闭塞区周围出现少量新生血管簇；P17时新生血管增殖达到高峰，可观察到大量新生血管簇，血管走形迂曲；P21时新生血管部分消退，新生血管簇缩小。见图2。

2.2 Western blotWestern blot检测结果表明，正常对照组和OIR组小鼠视网膜组织中均可见Cx43的表达，两组小鼠不同时间点Cx43的相对表达量。见表1。正常对照组和OIR组各时间点Cx43的表达量差异有统计学意义(F=486.815，P<0.001)，其中正常对照组P12 Cx43的表达量最高，与其他各时间点比较，差异有统计学意义(P<0.05)；OIR组P17 Cx43的表达量最高，与其他各时间点比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组P12、P14、P17各时间点Cx43的表达量与OIR组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组P21时Cx43的表达量与OIR组相比差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组Cx43的表达呈逐渐下降的趋势；OIR组Cx43的表达在出氧舱后先下降再上升，P17后又逐渐下降。见图3、4、5及表1。

图3 两组小鼠视网膜组织Cx43表达情况

白色箭头示新生血管簇；A为P12；B为P14；C为P17；D为P21。

A为P12；B为P14；C为P17；D为P21。

表1 正常对照组与OIR组在各时间点Cx43/GAPDH灰度值的比较

图4 对照组Cx43的动态表达(P<0.000 1)

图5 OIR组Cx43的动态表达(P<0.000 1)

3 讨论

3.1 视网膜新生血管的动态变化随着早产儿存活率的提高，ROP的发病率也呈上升趋势。研究表明我国体质量<2 kg或胎龄<34周的早产儿，或者因疾病接受氧疗超过5 d的新生儿中，ROP发生率为15.2%[9]。从临床角度看，ROP被认为是一种血管疾病，分2个阶段发展。当早产儿暴露在支持其未成熟呼吸系统所需的高水平氧气中时，控制视网膜血管成熟的正常过程被中断，导致外围视网膜无血管。当新生儿在后期回到正常空气中时，视网膜缺氧在外周无血管视网膜中发展，导致大量新生血管形成，容易发生出血、渗出等，严重者可引起视网膜脱离，视力丧失[10]。OIR小鼠模型是研究视网膜新生血管形成及转归最经典的动物模型,目前已经被广泛用于研究ROP发病机制的各个方面。当新生小鼠暴露在体积分数过高的氧气环境下时，从脉络膜循环中渗透入视网膜的氧增加，这会导致视网膜血管的生成减少以适应高氧供，当这种高氧供停止、新生小鼠返回正常氧供的空气环境时，就会造成视网膜相对性的缺氧，因此，一系列细胞因子会被释放出来介导异常的视网膜新生血管生成[11-12]。

Cx43是连接蛋白亚型中分布最广、研究最多的一种亚型[13]，在视网膜生理结构及功能上发挥着重要的作用。Cx43不仅对视网膜细胞的新陈代谢、增殖、分化和内环境的稳定等生理过程发挥重要的作用，而且能够协调视网膜组织的信息传递、物质交换、细胞代谢，除此之外，缝隙连接还参与细胞的分化及生长发育[14]。有研究表明，缝隙连接在眼胚胎的发育中，早期可以控制视网膜神经的发育，在成年后，Cx43参与视网膜的再生[15-16]。目前，Cx43已经在大鼠视网膜缺血再灌注模型[4]、光损伤的白化大鼠视网膜变性模型[5]以及其他中枢神经系统模型[6,17]等多种疾病动物模型中得到了广泛研究。

本研究显示，正常对照组P12、P14、P17、P21各个日龄视网膜铺片均未见视网膜新生血管，即正常情况下随着视网膜的发育无血管异常增殖。OIR组视网膜铺片显示P12时即高氧结束尚未进入相对低氧期时视网膜中央可见大面积的血管闭塞区，未见到病理性血管增殖；进入相对低氧阶段后，P14时血管闭塞区周围出现少量新生血管簇；P17时可观察到大量新生血管簇；P21时新生血管部分消退，新生血管簇缩小。由此也可以看到在相对低氧状态下，视网膜新生血管逐渐发生，P17达高峰，以后又逐渐减少的过程。这一结果与Smith等[8]的研究相一致，证明OIR小鼠模型制造成功，可以用于以后的实验。

3.2 OIR模型Cx43的动态表达OIR小鼠模型中视网膜新生血管的形成是一个渐进的过程，这个过程可以简单地概括为：增殖、出芽、形成、重塑4个阶段[18]。本实验选择在OIR病理Ⅱ期即视网膜新生血管增殖期的不同时期检测Cx43的表达，可以得到Cx43在新生血管从发生发展到消退整个时期的表达数据，对于后续的实验研究意义重大。

本研究结果显示，正常对照组和OIR组各时间点Cx43的表达量差异有统计学意义，其中正常对照组P12 Cx43的表达量最高，OIR组P17 Cx43的表达量最高，与组内其他各时间点比较，差异有统计学意义。P12、P14、P17各时间点Cx43的表达量正常对照组与OIR组相比，差异有统计学意义。同时观察到正常对照组Cx43的表达呈逐渐下降的趋势，OIR组Cx43的表达在出氧舱后先下降再上升，P17后又逐渐下降。

本研究认为Cx43可能参与视网膜新生血管的形成以及发生发展，在正常情况下连接蛋白表达的增加意味着在细胞膜中将有更多数量的非对立半通道，与此同时，这些通道显示出增加的开放概率，虽然这也可能为细胞内和细胞外环境之间的自分泌和旁分泌以及信号转导提供了一条途径，但是，开放的半通道将构成一个大的、相对非特异性的膜通道，这会导致内皮细胞肿胀、破裂，血管完整性丧失[19]。本研究在正常对照组观察到Cx43的表达在P12达高峰且呈逐渐下降的趋势，也证实了这个观点。小鼠处于高氧环境中时，正常血管闭塞，当小鼠回到室内空气中时，由于极度缺氧，病理性新生血管逐渐形成，在视网膜铺片中观察到视网膜新生血管在P17时达到高峰，与此同时，Cx43表达量在P17时也达到高峰，且高于正常对照组以及OIR组P12、P14时；在P21视网膜铺片中观察到新生血管的部分消退，而Cx43表达在此时也较P17时下降，且和正常对照组相比无明显差异，说明Cx43在视网膜新生血管的发生发展中起到了非常重要的作用。

综上所述，本研究首次从Cx43在OIR模型小鼠视网膜病变中的动态表达方面，证实了Cx43在视网膜新生血管发生发展中的作用，表明Cx43可能促进OIR小鼠视网膜病理性新生血管的形成以及发生发展。对于Cx43调节剂的研究可能为临床ROP的药物研发提供了一种新思路，而Cx43影响病理性新生血管形成的分子机制，尚有待进一步研究。