芪仙通络方及其拆方对脑梗死大鼠室管膜下区神经发生及p38MAPK活化的影响

周胜强，李博，王琦，周春吉，刘芳，邓奕辉

1.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；4.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳 421001

脑梗死又称缺血性卒中、中风，具有高发病率、高致残率、高病死率及高复发率等特点，已成为严重威胁我国居民健康的重大疾病之一[1]。对脑梗死后遗留的肢体瘫痪、麻木、失语等神经功能缺损后遗症，西医目前仍然缺乏安全、有效的治疗措施[2]。长期临床实践和观察表明，中医治疗可显著改善脑梗死后遗症，降低其致残率，提高患者生活质量，有望为脑梗死治疗开辟新途径[3]。

芪仙通络方系国医大师刘祖贻教授基于其创新理论“气阳主用”研制而成的中风效验方，在补肾活血基础上加以益气温阳，经多年临床实践证实，针对中风后神经功能缺损，其疗效显著优于单纯补肾活血法。课题组前期通过回顾性研究发现，芪仙通络方能促进脑梗死患者恢复及后遗症期肾虚血瘀证患者神经功能，提高其日常活动能力，且未见任何不良反应发生[4]。实验研究亦表明，本方能显著促进脑梗死大鼠神经功能恢复，上调缺血脑区脑源性神经营养因子（BDNF）表达，抑制胶质细胞过度活化，促进海马区神经干细胞再生，但未对室管膜下区内源性神经发生水平及分子调控机制进行探讨[5]。因此，本研究旨在通过拆方研究，比较芪仙通络方及其拆方对脑梗死大鼠神经功能、缺血侧室管膜下区神经干细胞增殖、迁移与神经元定向分化及p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活化的影响，探讨芪仙通络方补肾活血、益气温阳组方配伍的临床意义及促进神经功能恢复的可能作用机理，从而佐证“气阳主用”创新理论的临床指导价值，以期为脑梗死后遗症的防治提供新的思路与方法。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠80 只，体质量（240±30）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南省中医药研究院SPF 级实验动物中心，温度（24±0.5）℃，湿度50%，昼夜光照节律，自由摄食饮水，适应性喂养1 周。

1.2 药物及制备

芪仙通络方（黄芪30 g，淫羊藿15 g，丹参30 g，枸杞子30 g，制何首乌15 g，葛根30 g，水蛭9 g，山楂15 g）、补肾活血拆方（枸杞子30 g，制何首乌15 g，丹参30 g，葛根30 g，水蛭9 g，山楂15 g）、益气温阳拆方（黄芪30 g，淫羊藿15 g），饮片购自湖南省中医药研究院附属医院，经药剂科田其学主任药师鉴定，符合2015 年版《中华人民共和国药典》规定。芪仙通络方水煎后浓缩成原药材浓度为1.566 g/mL，补肾活血拆方水煎浓缩成原药材浓度为1.161 g/mL，益气温阳拆方水煎浓缩成原药材浓度为0.405 g/mL，置于4 ℃冰箱保存备用。胞磷胆碱钠胶囊，齐鲁制药有限公司，0.1 g/粒，批号8A0284E20，生理盐水溶解后稀释成浓度为0.005 4 g/mL。5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），美国Sigma 公司，货号B5002，用DMSO和生理盐水稀释成浓度为20 mg/mL（DMSO 终浓度为1 mmol/L）。

1.3 主要试剂与仪器

p-p38MAPK（Tyr323）抗体，北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-23251R；巢蛋白（Nestin）、双肾上腺皮质激素（DCX）、神经元核抗原（NeuN）、BrdU 抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为GB12137、GB11317、GB11138、GB12051；FITC标记山羊抗小鼠IgG、FITC 标记山羊抗兔IgG、CY3标记驴抗小鼠IgG、HRP 标记山羊抗兔IgG，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为GB22301、GB22303、GB21401、GB23301；DAPI，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1012；免疫组化试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司，货号G1215。硅胶包被线栓（广州佳灵生物技术有限公司，规格3600AAA），组织脱水机（武汉俊杰电子有限公司，型号JJ-12J），石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P5），石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），组织摊片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司，型号KD-P），微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司，型号P70D20TL-P4），正置光学显微镜（日本尼康，型号NIKON ECLIPSE E100），荧光显微镜（日本尼康，型号NIKON ECLIPSE TI-SR）。

2 实验方法

2.1 造模与评价

参照课题组前期研究方法[5]，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型。造模前12 h 大鼠禁食不禁水，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉；将大鼠仰卧位固定于手术操作台，取颈部正中切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉；结扎颈总动脉、颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，于颈总动脉上端近分叉处（约4 mm）用注射器针头刺一小孔，将直径为0.28 mm 的线栓插入颈内动脉，插入深度由分叉处计约18 mm，固定线栓，依次关闭切口。假手术组仅切开皮肤，暴露颈总、颈外、颈内动脉，不予线栓，其余步骤与手术组相同。大鼠清醒后，采用Longa 评分法[6]评定神经功能，评分越高表示神经功能缺损越严重。选取1～3 分大鼠纳入实验，死亡大鼠予以随机替补。

2.2 分组及给药

将30 只成模大鼠按随机数字表法分为模型组、芪仙通络方组（全方组）、补肾活血拆方组（拆方1组）、益气温阳拆方组（拆方2 组）和胞磷胆碱组，每组6 只，另设假手术组6 只。于MCAO 术后第3日开始灌胃干预，给药剂量根据人与大鼠体表面积换算，芪仙通络方组15.66 g/kg，拆方1 组11.61 g/kg，拆方2 组4.05 g/kg，胞磷胆碱组0.054 g/kg，给药体积均为2.5 mL，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每日1 次；同时标记BrdU 增殖细胞，参照文献[7]，大鼠按50 mg/kg腹腔注射BrdU溶液（20 mg/mL），连续12 d。

2.3 取材

大鼠末次灌胃4 h 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，同时夹闭腹主动脉，将注射器针头经心尖插入主动脉端并固定，生理盐水灌流，待心脏无血液流出及前爪、肺部颜色变白后，4%多聚甲醛100 mL 灌注，开颅取脑，去除小脑、脑干及嗅球后，将大脑置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱保存，用于免疫荧光和免疫组化检测。

2.4 神经功能评分测定

于造模后第3、7、14 日采用改良神经功能缺损评分[6]评定大鼠神经功能，对大鼠运动、感觉、反射和平衡能力进行全面评价，总分18 分，分值越高表示神经功能缺损越严重。

2.5 免疫荧光双标法检测神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化水平

采用免疫荧光双标法检测大鼠缺血侧室管膜下区Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 双标阳性细胞数，分别观察内源性神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化水平。将BrdU 标记的脑组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋，4 μm 连续冠状切片；60 ℃烤片2 h，常规脱蜡至水；EDTA（pH＝8.0）抗原修复23 min，2 mol/L 盐酸37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L 硼酸漂洗10 min，3%BSA 室温封闭30 min；分别加入BrdU 一抗（1∶100）、Nestin 一抗（1∶100）、DCX 一抗（1∶100）、NeuN 一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜；室温复温30 min，PBS 洗5 min×3 次，分别滴加FITC 标记山羊抗小鼠IgG（1∶50）、FITC 标记山羊抗兔IgG（1∶50）、CY3 标记驴抗小鼠IgG（1∶50），室温避光孵育1 h；PBS 洗5 min×3 次，滴加DAPI 染色液复染细胞核，室温避光孵育10 min；PBS 洗5 min×3 次，加入抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察。每张切片随机选取5 个缺血侧室管膜下区视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件计算单位面积内Nestin、DCX、NeuN 与BrdU 双标阳性细胞数，取其平均值进行定量分析。

2.6 免疫组化检测p-p38MAPK 蛋白表达

采用免疫组化检测大鼠缺血侧室管膜下区p-p38MAPK 蛋白表达。脑组织切片常规脱蜡至水，EDTA（pH＝9.0）抗原修复20 min；3%双氧水室温避光孵育25 min，滴加3%BSA，室温封闭30 min；加入p-p38MAPK（Tyr323）抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜；滴加HRP 标记山羊抗兔IgG（1∶500），室温孵育50 min，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水后中性树胶封片，光学显微镜下观察。以棕黄色颗粒为阳性表达，每张切片随机选取5 个缺血侧室管膜下区视野拍照采集图像，采用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件计算p-p38MAPK 蛋白表达的平均光密度（MOD），进行相对定量分析。

3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。实验数据以表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，相关性分析采用Pearson 相关分析法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 芪仙通络方及其拆方对模型大鼠神经功能评分的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损症状明显，各时间点神经功能评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组第7、14 日神经功能评分明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与拆方1 组、拆方2 组和胞磷胆碱组比较，全方组第7、14 日神经功能评分显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较（，分）

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分比较（，分）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与拆方 1 组比较，☆P＜0.05；与拆方2 组比较，▲P＜0.05；与胞磷胆碱 组比较，△P＜0.05

4.2 芪仙通络方及其拆方对模型大鼠室管膜下区神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化水平的影响

BrdU 阳性表达细胞核呈红色荧光，Nestin、DCX、NeuN 阳性表达细胞质呈绿色荧光，细胞核为蓝色荧光，Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 双标阳性细胞核为红色，胞质为绿色，分别代表神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化水平。假手术组大鼠缺血侧室管膜下区可见少量Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 双标阳性细胞，其中NeuN/BrdU 双标阳性细胞数最少；与假手术组比较，模型组Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 双标阳性细胞数均有所增加（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 双标阳性细胞数均明显增加（P＜0.01）；与拆方1 组、拆方2 组和胞磷胆碱组比较，全方组Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU双标阳性细胞数增加最明显（P＜0.05）。见图1、表2。

表2 各组大鼠缺血侧室管膜下区Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU双标阳性细胞表达比较（，个/mm2）

表2 各组大鼠缺血侧室管膜下区Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU双标阳性细胞表达比较（，个/mm2）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01；与拆方1 组比较，☆P＜0.05；与拆方2 组比较，▲P＜0.05；与胞磷胆碱组比较，△P＜0.05

图1 各组大鼠缺血侧室管膜下区Nestin、DCX、NeuN、BrdU 阳性表达（免疫荧光染色，×400）

4.3 芪仙通络方及其拆方对模型大鼠室管膜下区p-p38MAPK 蛋白表达的影响

假手术组大鼠室管膜下区有少量p-p38MAPK 蛋白表达，模型组p-p38MAPK 蛋白表达升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，各给药组p-p38MAPK 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与拆方1组、拆方2 组和胞磷胆碱组比较，全方组p-p38MAPK蛋白表达升高最明显（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠缺血侧室管膜下区p-p38MAPK 蛋白表达比较（免疫组化染色，×400，，每组6 只）

4.4 神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化细胞数与神经功能评分和p-p38MAPK 表达的相关性分析

造模后第14 日，采用Pearson 相关分析法分析全方组与模型组大鼠缺血侧室管膜下区神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化细胞数与神经功能评分和p-p38MAPK 蛋白表达的相关性。全方组大鼠缺血侧室管膜下区Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU 双标阳性细胞数与神经功能评分呈显著负相关（r＝-0.94，P＜0.01；r＝-0.91，P＜0.01；r＝-0.95，P＜0.01），与p-p38MAPK 蛋白表达呈显著正相关（r＝0.90，P＜0.01；r＝0.90，P＜0.01；r＝0.88，P＜0.01），见图3。提示芪仙通络方可能通过促进p38MAPK 磷酸化上调内源性神经发生水平，进而恢复脑梗死大鼠受损神经功能。

图3 神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化细胞数与神经功能评分、p-p38MAPK 蛋白表达的相关性分析

5 讨论

由于溶栓或机械取栓等血管再通疗法严格的时间窗限制，大部分脑梗死患者会留下不同程度的肢体瘫痪、失语等神经功能损伤后遗症[8]。西医采用康复锻炼、干细胞或外泌体移植、神经营养因子等方法治疗，以促进神经重塑或替代病灶丢失的神经元，但存在疗效不理想及治疗方法尚不成熟的问题[9]。

中医在促进脑梗死后神经功能恢复方面具有一定优势[10]。国医大师刘祖贻教授认为，肾藏精，精生髓，脑髓化生源于肾精。现代医学中的神经元胞体、突起、髓鞘、突触等结构均为中医学“脑髓”的重要组成部分。脑梗死所致功能缺损应归因于“脑髓亏损”，而“髓”属阴，促进梗死后神经再生过程即为促进肾精化脑髓的过程，其中肾阳的鼓舞、推动作用非常重要，即《黄帝内经》所谓“阳生阴长”。因此，刘祖贻教授创新性地提出了“气阳主用”理论[11]。芪仙通络方系在该理论指导下经多年临床实践研制而成的中风效验方。方中君药黄芪大补元气；淫羊藿佐君药黄芪益气温阳，温补肾中阳气，配伍制何首乌、枸杞子补肾填精，达助阳生阴之用，共为臣药；佐以丹参等活血通络之品。诸药合用，共奏益气温阳、补肾活血之功。目前医家多采用单纯补肾活血法、补肾益气活血法或补肾活血基础上加用附子、干姜等药力峻猛的温阳药治疗脑梗死[12-15]，而少有在补肾活血基础上加以柔和的益气温阳药，意在少火生气者。本研究结果表明，芪仙通络方及其拆方均可显著降低脑梗死大鼠神经功能评分，促进其神经功能恢复，其中又以全方组作用最佳，说明“气阳主用”创新理论及其指导下的补肾活血药与益气温阳药配伍具有协同增效作用。

脑梗死后神经功能缺损后遗症产生的根本原因是神经元减少[16]。目前普遍认为，成年哺乳动物室管膜下区、海马齿状回等部位存在神经干细胞，但正常情况下处于休眠状态[17]。而在特定条件如缺血、神经营养因子等因素刺激下，内源性神经发生可以被诱导，室管膜下区神经干细胞激活、增殖并向缺血纹状体区域迁移，同时分化为神经元并整合入神经环路[18]。如不进行干预，其分化为神经元的概率十分有限[19]。因此，近年来通过提高内源性神经发生水平促进神经功能恢复的治疗方法越来越受到关注[20-21]。在神经发生过程中，神经干细胞的增殖、迁移、分化受细胞内MAPK、Wnt、Notch、BMP 等信号通路及细胞外相邻细胞、细胞因子、激素、神经递质、细胞外基质等的精准调控[22]。其中作为MAPK 家族重要成员的p38MAPK 信号通路日益受到重视，该通路的关键元件p38MAPK 发生磷酸化是该通路激活的标志。既往研究发现，下调p-p38MAPK 表达可显著抑制体外培养的人海马神经干细胞增殖，抑制大鼠室管膜下区神经干细胞迁移及向神经元定向分化[23-25]。提示p38MAPK 在神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化过程中扮演关键角色。本实验结果显示，大鼠脑缺血发生后，缺血侧室管膜下区 Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 双标阳性细胞数较假手术组有所增加，同时p-p38MAPK 蛋白表达上调。芪仙通络方干预后，缺血侧室管膜下区Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及 NeuN/BrdU 双标阳性细胞数及p-p38MAPK 蛋白表达进一步升高，表明芪仙通络方能促进脑梗死大鼠缺血侧室管膜下区神经干细胞增殖、迁移、神经元定向分化及p38MAPK 活化。此外，通过Pearson 相关分析发现，芪仙通络方干预后，脑梗死大鼠缺血侧室管膜下区神经干细胞增殖、迁移及神经元定向分化细胞数与神经功能评分呈高度负相关，而与p-p38MAPK 蛋白表达呈高度正相关，进一步说明p38MAPK 信号通路介导的室管膜下区神经发生可能在芪仙通络方促进脑梗死大鼠神经功能恢复过程中发挥了重要作用。

综上所述，芪仙通络方及其拆方能改善脑梗死大鼠受损神经功能，其机制可能与促进缺血侧室管膜下区p38MAPK 活化、上调内源性神经发生水平有关，其中以全方组作用最佳。