自动染色机应用于病理术中快速冷冻切片的效果和价值

吴 颖，陈 娜，郭玉娟，吴坤河，郜红艺

术中快速冷冻病理切片能帮助外科医师决定手术方式和范围，使患者免受二次手术的痛苦[1]，而切片的染色质量直接影响病理诊断的准确性[2]。传统手工染色步骤操作繁琐、费时费力且人为因素的影响较大，切片的同时需兼顾染色，易导致染色质量不稳定[3]。因此，本科室引进一台NQ100S自动快速冷冻切片染色机，旨在保障冷冻切片的染色质量。虽然常规染色使用全自动染色机早已被广泛应用[4]，但是使用自动染色机对术中快速冷冻切片进行染色的相关报道相对较少，故本文就其应用效果和价值进行探讨。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2019年10月1日～2020年3月31日广东省妇幼保健院病理科接收的术中冷冻标本500例，每例标本连续切片2张，淋巴结组织3～4 μm厚切片，乳腺保乳手术切缘组织9～10 μm厚切片，乳腺肿块、肠管和卵巢肿块组织5～6 μm厚切片，固定后随机分为手工染色组和自动染色机组。

1.2 仪器与试剂广州耐确NQ100S自动快速冷冻切片染色机，Leica CM1950冷冻切片机，OCT冷冻包埋剂，乙酸 ∶95%乙醇 ∶甲醛为5 ∶85 ∶10组成的AAF固定液，80%乙醇，95%乙醇，无水乙醇，成品苏木精和伊红，1%盐酸乙醇，碳酸锂返蓝液，封片剂。当染色效果红蓝对比欠佳，图像欠鲜艳，提示染液试剂应更换。试剂更换的频率为苏木精和伊红每染200张冷冻切片更换1次，盐酸乙醇和碳酸锂溶液每染100张冷冻切片更换1次，乙醇每染50张冷冻切片更换1次。本实验中的旧试剂定义为使用次数超过上述标准一半量的试剂。

1.3 方法

1.3.1自动染色机染色 (1)标本冷冻切片贴片后置于AAF固定液中30 s；(2)启动一键式按钮进行染色，染色程序：水洗10 s→苏木精100 s→水洗10 s→1%盐酸乙醇1 s→水洗10 s→饱和碳酸锂水溶液8 s→水洗10 s→1%伊红4 s→水洗6 s→80%乙醇5 s→95%乙醇8 s→100%乙醇10 s→100%乙醇10 s；(3)染色机鸣笛提示染色结束，把玻片从出样缸中取出；(4)干燥后封片送病理医师诊断。

1.3.2手工染色 手工染色步骤按照自动染色机程序进行。

1.4 观察指标

1.4.1染色效果评分 由两位病理医师对切片HE染色进行双盲法独立评分，评分标准见表1，满分10分。鲜艳：细胞核呈蓝色，染色质呈颗粒状，胞质呈粉红色至桃红色，红蓝对比分明；较鲜艳：细胞核呈淡蓝色，胞质呈浅红色，红蓝对比欠清晰；不鲜艳：细胞核呈灰蓝色，染色质模糊，胞质呈浅灰红色，红蓝对比差。

表1 HE染色效果评分标准

1.4.3染色成本 成本主要包括设备成本、试剂成本和人力成本。

2 结果

2.1 手工组和自动染色机组的染色效果评分比较自动染色机组的淋巴结和保乳切缘的染色评分均高于手工组，差异有统计学意义(P<0.05)，染色效果对比见图1～4。两组乳腺肿块、肠管和卵巢肿块的染色评分差异均无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 不同组织的手工组和自动染色机组染色评分对比

图1 淋巴结手工染色：染色欠鲜艳 图2 淋巴结自动染色机染色：染色鲜艳 图3 保乳切缘染色：染色欠鲜艳 图4 保乳切缘自动染色机染色：染色鲜艳

2.2 手工组和自动染色机组染色效果稳定性的比较手工组中，使用旧试剂、切片质量差和室温≤10 ℃的染色评分分别低于使用新试剂、切片质量好和室温≥25 ℃的染色评分，差异有统计学意义(P<0.05)。自动染色机组中，使用旧试剂和室温≤10 ℃的染色评分与使用新试剂和室温≥25 ℃的染色评分差异无统计学意义(P>0.05)；而切片质量差的染色评分则低于切片质量好的染色评分，差异有统计学意义(t=3.779，P=0.001，表3)。

表3 不同因素对手工组和自动染色机组染色评分的影响

2.3 手工组和自动染色机组染色时效性的比较接收单例标本制作冷冻切片时，手工组和自动染色机组的染色时间[(615.04±133.40) svs(617.26±165.51) s]差异无统计学意义(t=-0.074，P=0.941)；同时接收2例标本制作冷冻切片时，自动染色机组的染色时间(986.80±167.60) s低于手工组(1 114.54±165.98) s，差异有统计学意义(t=3.829，P<0.001)。

2.4 手工组和自动染色机组的成本对比据统计，本科室平均每年约1 200例术中快速冷冻标本，平均1例需切片约5张，1年合计有冷冻切片6 000张。自动染色机的试剂缸容量为100 mL，手工染色的试剂缸容量为300 mL。根据各试剂购买价格和更换频率得出自动染色机的每年试剂支出成本约0.8万元，手工染色的每年试剂支出成本约2.4万元。两组的人工成本相同，每年约12.0万元。自动染色机购买价为10.0万元，按10年折旧计算，每年成本约1.0万元，总计自动染色机每年支出成本为13.8万元，比手工染色的每年支出成本14.4万元节省0.6万元。

3 讨论

本实验对比自动染色机与手工染色的效果评分后发现，自动染色机对淋巴结和保乳切缘两类组织的染色效果评分高于手工组，而两种染色方式对乳腺肿块、肠管和卵巢肿块三类组织的染色效果评分差异无统计学意义，提示保乳切缘和淋巴结等富含脂肪和淋巴成分的组织更适合于使用自动染色机进行染色，一方面可能与这两类组织切片难度较大有关，这两类标本都经常掺杂较多脂肪组织，若冷冻温度过低，易使组织变脆后造成切片脆裂，若冷冻温度不够又不能使脂肪组织冻硬从而造成切片呈糊状难以展平[5]；另一方面可能是手工染色时上下提插使染液冲力过大导致易脱片[6]，而自动染色机的机械臂运行缓慢、冲力较小，因此染色效果评分更高。乳腺肿块、肠管和卵巢肿块等组织的纤维背景更多，冷冻后稍硬，对染色条件与方式更有兼容性，不易造成染色效果的明显差异。

本实验发现人工染色使用旧试剂时的染色评分比使用新试剂时下降，而自动染色机组的染色评分无明显变化，可能与人工染色时使用的玻片架体积较大，在浸染切片的过程中会随着染色批次的增多而损耗更多的染液有关[7]，而自动染色机使用机械夹直接夹持玻片进行染色，不使用玻片架，浸入染液的只有玻片使得试剂还未有太多损耗从而保证较好的染色质量。冷冻切片质量的好坏直接影响冷冻切片的染色效果，如切片厚薄不均、有裂隙或褶皱、出现冰晶或空洞等均会导致切片不完整或有重叠从而使染色质量下降，因此与手工染色组一样，自动染色机组也在切片质量差时染色评分下降。自动染色机有恒温装置，染色效果不易受室温变化的影响，而手工染色则受个人水平不同和经验的影响，一方面难以调节染液的温度，另一方面个人对适当延长染色时间的把握不准，因而染色效果难以稳定导致评分下降。

当同一时间段接收2份冷冻标本时，使用自动染色机染色的时间比人工染色更短，这是由于技术员可在自动染色机对上例切片染色时对下一例标本进行切片，使技术员可以将更多的精力放在切片上，不仅提升了制片质量又缩短了整个制片时间。另外，每年手工染色比自动染色机的成本多0.6万元，可能与自动染色机的试剂缸容量较小，是手工染色试剂缸的1/3，以及其机械夹夹持玻片减少带液量有关，说明自动染色机可一定程度上节省试剂的损耗与成本。

综上所述，自动染色机与传统的手工染色相比，其染色效果更稳定，操作简单方便，可辅助病理技术员提高工作效率，缩短出具病理报告的时间，还节省了试剂成本，是病理技术室标准化平台建设的发展趋势，可在病理科中推广使用。