肝细胞肝癌中CENPF的表达及临床意义

李 丹，黄育刚，汤显斌

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的原发性恶性肝肿瘤之一，约占肝肿瘤的80%[1]。在我国HCC引起的肿瘤相关病死率位居第三，仅次于肺癌和胃癌[2]，其5年生存率低于18%[3-4]。CENPF(Centromeric protein F)是细胞周期相关的核抗原。研究表明，CENPF在肝癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7-8]等多种人类恶性肿瘤中存在异常表达。虽然关于CENPF在HCC中的表达情况已有报道[9]，但其生物学过程和分子机制等尚不清楚。本实验结合HCC临床样本及肿瘤基因数据库，对CENPF表达与患者预后的相关性、潜在信号通路进行探讨，以期为HCC的早期诊断、预后评估和抗肿瘤治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据提取运用GEO数据库、TCGA和Oncomine平台筛选与HCC相关的数据集。在GEO数据库中，包含人HCC及其邻近或正常肝组织，且病例数200以上的，共筛选到2个数据集，即GSE14520和GSE25097。基于TCGA、Oncomine平台中HCC相关信息，分析CENPF在HCC及正常肺组织中的表达差异、与临床分期及病理分级的相关性。此外，应用GEPIA平台分析CENPF与HCC患者预后的关系。

基于TCGA数据库，用SPSS 25.0软件进行CENPF表达与年龄、性别、临床分期、病理分级等临床参数的相关性分析；应用GSEA 4.0.3软件进行基因集富集分析，在HCC中，探索与CENPF基因表达可能相关的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、Hallmark和Biocarta信号通路。

1.2 材料收集2019年12月～2020年12月十堰市太和医院病理科存档的HCC及对应癌旁正常组织，选取有完整病历及临床信息全面的样本，合计18例；所有病例均未行放、化疗，所有病理指标均经过两位病理医师重新评定，并达成一致的意见。

1.3 免疫组化对18例HCC及癌旁正常组织，各取3 μm厚组织切片，用EDTA(pH 9.0)进行热修复，玻片与CENPF抗体(英国Abcam公司，稀释浓度1 ∶400)在37 ℃孵育1 h，再用辣根过氧化物酶标记的二抗(福州迈新公司，货号KIT5230)37 ℃孵育0.5 h，苏木精复染30 s。在光学显微镜下观察，并评估肿瘤细胞中CENPF蛋白表达的阳性细胞占比。

1.4 统计学分析所有数据采用Graphpad Prism 8.2软件作图并运用SPSS 25.0软件进行统计学分析，正常组织与HCC组织中CENPF的表达差异比较采用t检验，设定P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同HCC芯片中CENPF的表达对GEO的两个数据集应用GEO2R进行表达差异分析，GSE14520数据集包含220例正常肝组织和225例HCC组织，GSE25097数据集包含243例正常肝组织和268例HCC组织。在GSE14520和GSE25097数据集中，CENPF在HCC中的表达量均高于正常肝组织(P<0.000 1，图1A、B)。TCGA数据库包含50例正常肝组织和388例HCC组织，分析显示CENPF在HCC中的表达量高于正常肝组织(P<0.000 1，图1C)。通过Oncomine平台分析Chen等的HCC数据(包含62例正常肝组织和101例HCC组织)，结果显示CENPF在HCC中的表达量高于正常肝组织(P<0.000 1，图1D)。本组免疫组化检测显示CENPF表达定位在细胞核，且在HCC中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.000 1，图2)。

2.2 HCC中CENPF与临床病理特征的关系在TCGA中，根据CENPF表达的中位值将374例HCC样本分为低表达组(187例)和高表达组(187例)，分析CENPF表达与HCC临床病理特征的关系。在HCC中，CENPF表达与患者年龄、性别、有无血管侵犯无关。随着临床分期升高，CENPF高表达例数显著多于CENPF低表达例数(尤其临床分期Ⅱ、Ⅲ期，P=0.002，表1)。随着病理分级升高，CENPF高表达例数显著多于CENPF低表达例数(尤其病理分级3级，P<0.001)。CENPF高表达者更容易发生肿瘤复发。AFP为肝癌的特异性标志物之一，当AFP浓度>400 μg/L时，CENPF高表达例数显著多于CENPF低表达例数(P<0.001)。

表1 HCC中CENPF表达与临床病理特征的关系

此外，采用单因素、多因素Cox回归分析，探讨CENPF表达与HCC患者年龄、性别、分级、TNM分期、肿瘤复发等临床因素对患者预后的影响。单因素Cox回归分析表明CENPF表达和TNM分期与HCC患者的预后相关(P<0.01)。多因素Cox回归分析表明CENPF表达和TNM分期是HCC患者的独立预后因素(P<0.01，表2)。

表2 CENPF在肝细胞肝癌中的单因素、多因素Cox回归分析

2.3 CENPF在HCC不同临床分期、病理分级中的表达结合TCGA表达矩阵及对应的临床信息，分别分析了CENPF mRNA在正常组织及临床分期Ⅰ～Ⅳ期、病理分级1～4级中的表达量。结果显示，CENPF mRNA表达量与临床分期(图3A)和病理分级(图3B)呈正相关，表明CENPF异常表达与HCC恶化程度及疾病的进展相关。

图3 HCC不同临床分期、病理分级中CENPF的表达：A.临床分期；B.病理分级；ns. P>0.05，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1

2.4 HCC中CENPF表达与预后的关系应用GEPIA平台绘制生存曲线，结果显示CENPF表达与患者预后，即总生存率、无瘤进展生存率均呈负相关性(P=0.001 8，P=0.001 9，图4)。

图4 CENPF表达与HCC患者预后的关系：A. CENPF表达与HCC患者总生存率的关系；B. CENPF表达与HCC患者无瘤进展生存率的关系；P<0.01

2.5 CENPF在HCC中的基因集富集分析基于TCGA数据库使用GSEA软件进行基因集富集分析，探讨CENPF在HCC发生发展中潜在的分子机制。GSEA分析显示，在HCC中，与CENPF高表达最密切相关的KEGG信号通路是细胞周期(图5A)；与CENPF高表达最密切相关的Hallmark信号通路是转录因子E2F及细胞周期G2/M期转换(图5B)；与CENPF高表达最密切相关的Biocarta信号通路是MAPK信号通路(图5C)。

图5 CENPF在HCC中的GSEA富集分析：A. CENPF的KEGG富集分析；B. CENPF的Hallmark富集分析；C. CENPF的Biocarta富集分析；NES.标准富集分数(Normalized enrichment score)

3 讨论

目前，外科手术是治疗早期HCC的主要方式，大部分HCC患者在确诊时已失去手术治疗的最佳时机。近20年来，分子生物学研究陆续发现了TERT、TP53、CTNNB1等与HCC发生发展的相关基因及相关靶向药物。然而，HCC晚期患者对临床上使用的大多数化疗药物表现出耐药现象[10]。另外，这些基因突变只存在于部分HCC患者中，因此继续寻找HCC发生、发展的关键分子或靶点，对于研发治疗HCC的新药物具有重要的理论和临床意义。

CENPF的主要功能是在有丝分裂期维持纺锤体的稳定及分布[9]。已有研究表明，CENPF表达异常与肝癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的进展或预后有密切联系，而关于CENPF在HCC中的生物学过程及分子机制鲜有报道[11]。本实验基于多个公共数据库和临床样本的分析显示，与正常肝组织相比，HCC组织中CENPF显著高表达(P<0.001)。CENPF高表达与临床分期、病理分级呈正相关，与患者预后呈负相关，这表明CENPF异常表达与HCC的恶化程度及疾病进展相关。通过CENPF表达与临床病理特征的相关性及单因素、多因素Cox回归分析表明，CENPF表达与临床分期、病理分级、AFP及肿瘤复发密切相关，且CENPF可能是HCC患者预后的独立预后因素。通过GSEA分析表明，CENPF表达与HCC细胞周期调控密切相关，CENPF可能通过转录因子E2F、MAPK信号途径调控HCC细胞在G2/M期的转换，从而影响细胞周期，但这些推论还需要分子生物学实验等进一步验证。

综上，本实验分析了CENPF表达与HCC发生、发展的相关性，为进一步探讨分子机制提供了理论支持和线索，以期对HCC发生和发展相关的研究提供参考。