p16/Ki-67联合检测对TCT阴性高危型HPV感染者子宫颈病变的诊断价值

金 红，刘圆圆，张 念，赵 敏

子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，严重威胁患者的身心健康。早期诊断子宫颈癌可有效提高患者的治愈率及长期存活率[1]。子宫颈高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)为子宫颈癌的癌前病变，因此，早期识别HSIL及可能发展为HSIL的病变对于子宫颈癌的筛查和预防至关重要[2]。近年来，薄层液基细胞学检查(thin-cytologic test, TCT)和人类乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)检测在临床中应用广泛，然而由于种种因素的影响，TCT和HPV检测的敏感性及特异性偏低[3]。因此，进一步寻找一种简单、方便且准确性高的新技术便成为亟需解决的问题。p16/Ki-67联合检测对于子宫颈癌的检出有较高的敏感性及特异性，近年多用于辅助子宫颈癌筛查。本文对150例TCT阴性的高危型HPV感染者行阴道镜活检和p16/Ki-67联合检测，探讨p16/Ki-67联合检测应用于子宫颈病变筛查中的可行性及应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2020年5月～2021年1月合肥市第一人民医院收治的患者150例。纳入标准：高危型HPV检测阳性但TCT阴性者；近1周内无性生活或阴道灌洗上药等阴道操作；既往无子宫颈癌前病变史；无心、肝、肾等基础疾病。排除标准：患有免疫系统疾病，给予免疫抑制药物应用者；妊娠期、哺乳期妇女；其他良、恶性肿瘤患者。

1.2 方法于阴道镜下行子宫颈活检，标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用免疫组化SP法检测p16、Ki-67的表达。p16阳性结果判定：表达定位于细胞核或细胞质，鳞状上皮无表达为(-)，仅少数散在上皮细胞阳性为局灶阳性(+)，10%～90%的上皮细胞阳性为部分阳性()，≥90%的上皮细胞阳性为弥漫阳性()。Ki-67阳性结果判定：阳性定位于细胞核，阳性细胞仅位于基底层为(-)，阳性细胞位于上皮内下1/3层为(+)，阳性细胞位于上皮内下2/3层为()，阳性细胞位于上皮内全层为()[4]。

2 结果

2.1 临床特征本组共纳入150例子宫颈病变患者，患者年龄26～65岁，子宫颈阴性病变者88例，子宫颈阳性病变者62例，其中CIN Ⅰ级者36例，CIN Ⅱ级者20例，5例CIN Ⅲ级，1例子宫颈癌。

2.2 p16/Ki-67在各级别子宫颈组织中的表达p16/Ki-67子宫颈阳性病变者共62例(41.3%)，其中CIN Ⅰ级36例(24%)，CIN Ⅱ级20例(13%)，CIN Ⅲ级5例(3%)，子宫颈癌1例(0.7%)。p16/Ki-67联合检测在各级别病变中的双阳率分别为：CIN Ⅰ级55.6%，CIN Ⅱ级85%，CIN Ⅲ级及子宫颈癌均为100%(表1，图1～5)。

图1 A.正常子宫颈鳞状上皮HE染色；B.免疫组化p16呈阴性，SP法；C.免疫组化Ki-67少许散在阳性，SP法 图2 A.CIN Ⅰ级HE染色；B.免疫组化p16局灶斑片状阳性，SP法；C.免疫组化Ki-67增殖指数约50%，SP法 图3 A.CIN Ⅱ级HE染色；B.免疫组化p16阳性，SP法；C.免疫组化Ki-67增殖指数约60%，SP法

表1 各级别子宫颈组织中p16/Ki-67的表达[n(%)]

2.3 p16/Ki-67联合检测对子宫颈病变诊断的价值p16/Ki-67联合检测对子宫颈病变的敏感度为69.4%，特异度为87.5%，阳性预测值为79.6%，阴性预测值为80.2%，在CIN Ⅱ级及以上病变的敏感度为88.5%，特异度为96.6%，阳性预测值为67.6%，阴性预测值为96.3%，均高于CIN Ⅰ级病变组(表2)。

表2 p16/Ki-67联合检测对于子宫颈病变诊断的价值[n(%)]

3 讨论

子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，近年其发病率逐年上升且呈年轻化趋势，严重威胁患者的身心健康。子宫颈癌的发生、发展有较长的癌前病变阶段，一般需10～15年[5-6]。因此，早期筛查子宫颈癌前病变对于预防子宫颈癌的发生、发展至关重要。现阶段，临床上主要采取“三阶梯”法进行普查，即TCT/HPV DNA检测-阴道镜检查-子宫颈活检[7]，其中以子宫颈活检组织病理学检查为最终确诊依据。子宫颈癌的发生发展与高危型HPV感染密切相关，TCT对子宫颈病变(尤其是高危型HPV感染)的早期筛查至关重要。近年TCT和HPV检测在临床中应用广泛，由于种种因素的影响，TCT和HPV检测的敏感性及特异性偏低[3]。因此，临床中亟需一种新的敏感性和特异性较高的筛查手段，以降低漏诊和误诊的风险。本组中150例TCT阴性的高危型HPV感染患者中，子宫颈阳性病变者62例(41.3%)，其中CIN Ⅰ级36例(24%)，CIN Ⅱ级20例(13.3%)，CIN Ⅲ级5例(3.3%)，子宫颈癌1例(0.7%)，而达到CIN Ⅱ级以上病变者共26例(17.3%)，亦证实TCT筛查确实存在一定的漏诊率。

图4 A.CIN Ⅲ级HE染色；B.免疫组化p16阳性，SP法；C.免疫组化Ki-67增殖指数约80%，SP法 图5 A.子宫颈癌HE染色；B.免疫组化p16阳性，SP法；C.免疫组化Ki-67增殖指数约60%，SP法

文献报道，p16及Ki-67与子宫颈癌的发生、发展及预后密切相关[8]。p16基因定位于9p21，其表达产物p16蛋白可抑制细胞周期中蛋白激酶的活性，从而阻止细胞增殖[9-10]。当p16基因出现突变时，可导致细胞恶性增殖。本组中p16在子宫颈阴性病变中的阳性率仅为17.0%，在CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级及子宫颈癌中的阳性率分别为75.0%、90.0%、100%、100%，在子宫颈阳性病变组中的阳性率高于阴性病变组，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，推测p16与子宫颈上皮内病变关系密切，并且随着子宫颈上皮内病变的程度加深而升高。Ki-67系增殖细胞核抗原之一[11]，参与细胞有丝分裂的整个周期过程，主要反映细胞增殖活性[12-13]。Mitildzans等[14]研究表明Ki-67随着病变程度增加呈逐渐增强的趋势。本实验结果发现，Ki-67在子宫颈阴性病变中的阳性率仅为29.5%，在CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级及子宫颈癌中阳性率分别为80.5%、95.0%、100%、100%，在子宫颈阳性病变组的阳性率高于阴性病变组，差异有统计学意义(P<0.05)，与文献报道一致。

正常生理状态下，p16和Ki-67在细胞内表达处于动态平衡状态，两种基因相互制约，共同调控细胞周期，且不会同时出现在同一细胞中。若p16和Ki-67双阳性则表示细胞周期调控失调，高度提示有子宫颈病变可能，尤其是子宫颈CIN Ⅱ级以上病变[15]。本组子宫颈阴性病变组中，p16/Ki-67双阳率仅为12.5%，而子宫颈阳性病变中双阳率为69.4%，其中在CIN Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级及子宫颈癌中双阳率分别为：55.6%、85.0%、100%、100%。且既往有研究表示，病变程度越高其阳性率越高。本组中p16/Ki-67联合检测对检出CIN Ⅰ的敏感度为55.6%，特异度为81.8%，阳性预测值为64.5%，阴性预测值为82.8%，在CIN Ⅱ级以上病变的敏感度为88.5%，特异度为96.6%，阳性预测值为67.6%，阴性预测值为96.3%，均高于CIN Ⅰ级病变组，由于子宫颈CIN Ⅲ级及子宫颈癌组病例较少，其检出率有待于大样本进一步分析。

Margot等[16]的队列研究发现，TCT阴性合并高危型HPV阳性患者在随访过程中有12.2%的概率发展为CIN Ⅱ级及以上病变。因此，如何预测TCT正常合并高危型HPV阳性患者的病情转归有重要的临床意义，以便于对高危人群进行分层管理。运用p16/Ki-67双染检测技术对TCT阴性的高危型HPV感染子宫颈病变的检出具有较高的灵敏度和特异度，能够弥补细胞学检查的灵敏度不足，减少漏诊。p16/Ki-67双染检测作为新兴的子宫颈癌筛查技术，判读客观明确，临床上可考虑将p16/Ki-67联合检测应用于子宫颈癌早期筛查，及时预测和发现HSIL等病变，做到早诊断、早治疗。本实验由于样本量不足、染色技术等问题使研究结果受到限制，尚有待于大样本、大数据进行更完善的实验设计，充分分析p16/Ki-67联合检测对子宫颈病变的价值。