白藜芦醇介导Nrf2/ARE信号通路对大鼠草酸钙肾结石模型的抗氧化损伤作用

阿不都赛买提·艾力，辛瑞平，阿斯木江·阿不拉，郭明月，关永志，陈庆虎，木拉提·马合木提

(1.伊犁哈萨克自治州新华医院泌尿外科，新疆伊宁 835000；2.新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，新疆乌鲁木齐 830054；3.新疆医科大学第二附属医院泌尿外科，新疆乌鲁木齐 830063)

肾结石是一种常见病，手术费用较高又容易复发，故如何预防肾结石及其复发成为现代泌尿外科面临的最大挑战之一[1]。有资料显示，肾组织中草酸和草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的损伤是结石形成的关键环节之一[2]。当细胞因各种原因受损时，细胞内大量产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在促进氧化损伤过程中起着重要作用[3]。肾小管上皮细胞含内源性细胞防御系统能够对抗氧化应激反应，核因子E2相关因子 2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)是该系统的一个关键调节因子[4-5]。Nrf2在肝、肾、肺等组织细胞中普遍表达，并且在细胞应激增加时转移到细胞核中，与抗氧化原件(antioxidant response elements，ARE)结合，启动氧化还原相关的靶基因蛋白质的表达，阻止ROS的升高，从而保持细胞的内稳态平衡[6]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种具有抗氧化、抗衰老功能的天然多酚类化合物，能减少或清除ROS的产生[7-9]，但Res能抑制草酸引起的肾小管上皮细胞损伤，减轻或抑制草酸钙肾结石形成的研究报道尚少见。鉴于此，本研究主要探讨Res在大鼠草酸钙肾结石模型中与Nrf2抗氧化作用的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级健康雄性SD大鼠24只，7～8周龄，体质量180～220 g，由新疆医科大学动物实验中心提供。

1.2 实验材料及仪器乙二醇、氯化铵购自美国Sigma公司；Res(批号 H20181208，产地：西安，纯度：99.4%)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehde，MDA)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。-80 ℃超低温冰箱(型号DW-86L388J，山东海尔)，化学发光成像仪系统(型号Chemiscope 3000，上海勤翔科学仪器有限公司)，光学显微镜(型号BX41，Olympus)，大鼠代谢笼(苏州冯氏笼具厂)，饲料(江苏美迪森生物医药有限公司)。

1.3 动物分组、造模将24只SD大鼠适应性喂养7 d，12∶12 h明暗昼夜循环，标准实验鼠粮，自由供食水。采用随机数字表，将大鼠随机分为正常对照组、结石模型组、结石模型+Res干预组，每组8只。根据文献[10]报道的方法，正常对照组自由饮食水；结石模型组自由饮水并用乙二醇+氯化铵混合液灌胃，2 mL/d；结石模型+Res干预组在结石模型组的基础上加用Res灌胃，每日200 mg/kg[11]，与结石模型组药物间隔8 h。3组其他饲养条件均一致，连续28 d，末次给药24 h后，水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉后剖腹并取肾，一侧肾脏立刻放入液氮中待做肾组织匀浆，另一侧肾脏浸泡在多聚甲醛液中用于病理分析,最后颈椎脱臼处死大鼠。

1.4 肾组织病理学检查石蜡组织切片制作：各组大鼠肾组织制作石蜡切片后行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，光镜观察并拍照。结晶评分标准：0级为无结石、结晶形成；1级为少量结石、结晶形成，每个视野3个以下；2级为较多的结石、结晶形成，每个视野3～5个；3级为较多结石、结晶形成，每个视野6～10个；4级为大量结石、结晶形成，每个视野10个以上，甚至结石、结晶成团，堵塞肾小管。将0-4级分别记为1、2、3、4、5分[12]。

1.5 实时荧光定量聚合酶连锁反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR)测定肾组织Nrf2的mRNA表达取大鼠肾组织样本，采用Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的含量及纯度后按照逆转录试剂盒(TaKaRa 公司，日本)说明合成cDNA。PCR扩增所用Nrf2的上游引物序列为5′-TTCCTCTGCTGCCATTAGTCAGTC-3′，下游引物引物序列为 5′-GCTCTTCCATTT′CCGAGTCACTG-3′；β-actin的上游引物序列为 5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′，下游引物序列为 5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′。93 ℃预变性5 min，61 ℃退火1 min，71 ℃延伸50 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.6 Western blot测定肾组织Nrf2的蛋白水平液氮研磨后取100 mg肾组织，加入500 μL RIPA裂解液(已加入蛋白酶抑制剂)，充分混匀。4 ℃放置60 min后冰上匀浆，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度。取总蛋白30 μg，经SDS-PAGE电泳分离、转模和封闭后，加入抗Nrf2(1∶500)和抗β-actin(1∶2 500)抗体4 ℃孵育过夜，加入Ⅱ抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，在ChemiScope 化学发光成像仪系统中检测、拍照，用ImageJ软件测量条带灰度值，以β-actin为内参照，进行定量分析。

1.7 肾组织氧化应激指标的检测取1 g肾皮质，剪碎并加入适量冷裂解液后进行研磨匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，严格按说明书步骤检测MDA、SOD、CAT、GSH含量。

2 结 果

2.1 各组肾组织病理损伤及结晶评分的比较光学显微镜下观察肾组织，HE病理切片显示(图1)：正常对照组大鼠肾皮质、髓质无结晶形成，无钙化点，细胞排列整齐，结构清晰；结石模型组大鼠皮质肾小管区可见管腔显著扩张、萎缩改变及大量透明的草酸钙结石晶体；结石模型+Res干预组：大鼠肾小管区扩张伴炎症反应，未见明显结石晶体沉积，可见极少量结石晶体沉积和炎症细胞浸润，图1。

结石模型组大鼠的结晶评分(8.6±3.1)明显高于正常对照组(1.0±0.0)和结石模型+Res干预组(1.3±0.7)，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 肾组织Nrf2的mRNA转录水平RT-qPCR结果显示，与正常对照组相比，结石模型组大鼠肾组织中Nrf2 的mRNA表达量明显降低(P<0.05)；与结石模型组相比，结石模型+Res干预组能够显著提高Nrf2的mRNA的表达量(P<0.05，图2)。

*与对照组比较，P<0.05；#与结石组比较，P<0.05。

2.3 肾组织Nrf2蛋白半定量分析结果Western blot方法检测结果显示，与正常对照组相比，结石模型组大鼠肾组织中Nrf2蛋白的表达量明显降低(P<0.05)；与结石模型组相比，结石模型+Res干预组能够显著提高Nrf2蛋白的表达量(P<0.05，图3)。

A：正常对照组，B：结石模型组，C：结石模型+Res干预组。*与对照组比较,P<0.05；#与结石组比较，P<0.05。

2.4 肾组织MDA、GSH、SOD、CAT含量的测定结果与正常对照组相比，结石模型组大鼠肾组织中MDA的含量明显升高(P<0.05)，而CAT活力、SOD及GSH含量显著降低(P<0.05)；与结石模型组相比，结石模型+Res干预组大鼠肾组织MDA的含量明显降低(P<0.05)，而CAT活力、SOD及GSH含量显著升高(P<0.05，见图4)。

A:丙二醛(MDA);B:超氧化物歧化酶(SOD);C:过氧化氢酶(CAT);D:谷胱甘肽(GSH);*与对照组比较,P<0.05；#与结石组比较，P<0.05。

3 讨 论

近年流行病学调查研究显示，世界各地肾结石病的发病率正在逐年增高[13]。虽然发展迅速的微创手术拓展了肾结石切除术的治疗范围、提高了结石清石率，但肾结石高发病率与高复发率仍是泌尿外科医师面临的问题。国外研究者对2 200余例泌尿系结石患者进行了回顾性队列研究，结果显示：初次发病者，结石处理后2、5、10、15年的复发率分别为11%、20%、31%、39%[14]，故怎样预防高复发率已成为热点问题之一。目前关于草酸钙肾结石形成的确切机制尚未清楚，但肾小管上皮细胞氧化损伤和尿液中抑制成石物质的减少致结石晶体粘附、聚集的理论依据已不断被证实[15]。此外，高草酸尿和晶体沉积与脂质氧化和肾小管上皮细胞损伤之间有着密切联系[16-17]。故本研究在前期实验的基础上，用乙二醇促进大鼠尿中草酸和草酸钙的形成，氯化铵促进肾小管上皮细胞的损伤，最终成功建立SD大鼠草酸钙肾结石模型[18]。KHAN等[19]研究发现，ROS是肾脏氧化应激过程中的重要介体，在高草酸尿症或草酸钙肾结石形成过程中可能参与各种信号通路。因此，许多研究者在建立草酸钙肾结石大鼠模型的同时，通过使用抗氧化剂来减少或干预ROS的产生，进而改善由草酸引起的氧化损伤，防止草酸钙晶体粘附成石[20-21]。

Res又名 3,4′,5-三羟基芪，是一种多酚类化合物[22]，广泛存在于自然界多种植物中，如葡萄(尤其是葡萄皮)、蓝莓、花生和红葡萄酒中，其具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[23]。本研究发现：结石模型大鼠肾组织切片HE染色后光镜下可见肾小管内大量呈透明、片状草酸钙晶体形成，而结石模型+Res干预组中肾小管扩张不明显、周围炎细胞浸润以及管腔内草酸钙晶体明显减少，提示Res通过其抗氧化作用可以有效干预结石晶体粘附、聚集和生长。肾结石形成过程的主要环节离不开肾小管上皮细胞的氧化损伤，而Res正是以其具有的抗氧化作用来降低草酸所诱导的ROS和MDA形成以及促进SOD的活性，抑制结石的形成[24]。

在氧化应激存在时，大量形成的ROS可以损害细胞脂质、蛋白质及DNA，此时可以测定脂质过氧化产物，如MDA可以间接了解机体的氧化损伤程度[25]。研究还发现细胞内有一些抗氧化酶，对抗ROS及清除自由基来保护细胞的完整性，如SOD、GSH、CAT[26]。本研究发现，结石模型组肾组织匀浆中MDA含量增加，表明大鼠体内发生氧化损伤反应，而SOD、GSH、CAT含量降低，提示机体抗氧化能力减弱。而结石模型+Res干预组中MDA含量明显降低，SOD、GSH、CAT含量明显升高，说明Res通过上调该抗氧化酶的表达起到抗氧化应激作用。

Res的抗氧化损伤作用在多种疾病中都与 Nrf2/ARE 信号通路有关[27]。Nrf2/ARE 通路是氧化应激反应中的关键通路，其中Nrf2为机体降低ROS、减轻氧化应激的重要转录因子，Keap1是调节Nrf2活性细胞抗氧化途径的调节蛋白[28]。正常情况下Nrf2在胞质中与抑制因子Keap1结合，处于失活状态，无法进入细胞核发挥转录活性，当受到ROS刺激时，Keap1构象改变后与Nrf2解离[29]。激活的 Nrf2 进入细胞核，识别并结合DNA上的ARE结合，由此促进下游靶基因的表达，介导一系列下游抗氧化应激酶的产生，提高机体抗氧化能力[30-31]。本研究采用RT-qPCR和Western blot法对各组大鼠肾组织Nrf2的mRNA和蛋白表达水平进行半定量分析，结果发现结石模型组Nrf2的mRNA和Nrf2蛋白的表达较正常对照组明显下降，考虑其原因可能是因乙二醇与氯化铵引起的氧化损伤过程中Nrf2蛋白消耗增加所致，而给予Res后则激活Nrf2转为入核，上调下游抗氧化酶SOD、GSH、CAT的表达，清除或减少由草酸诱导产生的ROS，减轻氧化损伤，提高肾小管上皮细胞的抗氧化损伤能力。说明Res可能通过调控Nrf2信号通路抑制草酸钙成石作用，其具体机制仍需进一步深入探讨。

综上所述，本研究证实Res可以显著干扰乙二醇和氯化铵所引起的大鼠肾脏草酸钙结石的形成，并初步揭示了其作用机制可能与Nrf2/ARE信号通路有关，但氧化应激所涉及的其他信号通路也很多，如Wnt信号通路、PI3K/AKT信号通路、AMPK信号通路，且每一个信号通路之间相互关联，具体机制仍需要进一步研究探讨。