益根调理口服液质量标准及其免疫调节研究

蒋林，陈海燕，随家宁，郭勇秀，谢孟姣，赖信宏，李芳婵*（.广西中医药大学，南宁530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；3.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁 530200）

益根调理口服液是在中医药理论基础上，采用药食两用的药材所开发的中药复方保健食品口服液，由黄精、桑椹、灵芝、沙棘、益智仁、五指毛桃及覆盆子7 味药组成，具有良好的增强免疫力、抗氧化、辅助改善记忆、缓解体力疲劳等保健功效，用于年老体弱、形体消瘦、贫血、再生障碍性贫血、气虚质等人群日常养生。方中君药黄精功善补中益气、养阴益精可达气阴双补[1]，臣药桑葚、灵芝分别助黄精滋阴、补气之功[2-3]，佐药覆盆子及益智仁均具有益肾固精缩尿之功效[4-5]；沙棘健脾消食、五指毛桃健脾补肺，全方以此两味为反佐药可“以泻助补”。益根调理口服液目前为止还未制订相关的质量标准，本实验采用薄层色谱法对该口服液的4 味药材进行初步的药材鉴别，采用高效液相色谱法同时测定补骨脂素、鞣花酸成分含量研究，为建立益根调理口服液质量标准提供科学依据；同时对其免疫调节作用进行药效学研究，为该口服液进一步研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2020C 3D plus 高效液相色谱仪（日本岛津），超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），分析天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器有限公司），漩涡混合器（常州越新仪器制造有限公司），数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），超纯水制备机（中国密理博有限公司），三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司），硅胶GF254薄层板、双槽展开缸、SpectraMax i3x 型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]，SWCJ-2FD 型双人单面垂直净化工作台（苏州净化设备有限公司），TD5A 型台式多管架离心机（长沙英泰仪器有限公司）。

1.2 试药

益根调理口服液的处方中黄精、桑椹、灵芝、沙棘、益智仁、覆盆子和五指毛桃药材均购买自华泰中药饮片责任有限公司，由广西中医药大学中药鉴定教研室田慧教授分别鉴定为黄精（Polygonatum sibiricumRed.）的干燥根茎、桑椹（Morus albaL.）的干燥果穗、灵芝（GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang）的干燥子实体、沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）的干燥成熟果实、益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果实、华东覆盆子（Rubus chingiiHu）的干燥果实、桑科植物粗叶榕（Ficus hirtaVahl）的干燥根。鞣花酸对照品（成都麦德生科技有限公司，批号：RP190721，含量：99.58%）、补骨脂素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110739-201918，含量：99.6%）以及益根调理口服液（批号分别为：20191029、20200512-1、20200512-2、20200512-3、20200512-4、20200512-5、20200512-6，由广西中医药大学广西壮瑶药工程中心实验室自制，每瓶45 mL）；RPMI 1640 完全培养液（批号：AD23107271，美国Gibco 公司），ConA（批号：1012J033）、台盼蓝（批号：620C055）（北京索莱宝科技有限公司），MTT（批号：M2128，美国Amresco 公司），印度墨汁（批号：0919A17，北京雷根生物技术有限公司）等。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 益根调理口服液质量标准研究

2.1 益根调理口服液制备

取黄精、桑椹、灵芝、沙棘、益智仁、五指毛桃及覆盆子7 味药材处方量，回流提取2 次，提取液混合，热滤浓缩，混匀过滤，添加适量蔗糖，分装，即得每瓶45 mL 益根调理口服液（1 mL 相当于1.28 g 生药量）。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 沙棘薄层鉴别 取益根调理口服液2 mL置于分液漏斗中，加水至10 mL，乙酸乙酯连续萃取3 次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，待滤液蒸干后，残渣添加甲醇1 mL 溶解，即得供试品溶液。依据处方比例称取除了沙棘外的其他6味药材，按“2.1”项下方法制得阴性样品；取缺沙棘的阴性样品1 mL，以供试品溶液处理方法得到沙棘阴性样品溶液。另取沙棘对照药材1 g，加入乙酸乙酯30 mL 超声（功率200 W，频率40 kHz）提取30 min，滤液蒸干后，残渣加入甲醇1 mL 溶解，即得沙棘对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、沙棘对照药材溶液、阴性样品溶液各5、13、10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液进行显色。在105℃加热至斑点显色清晰，放冷至室温后在365 nm 紫外灯下观察。沙棘薄层色谱图中，供试品色谱与对照品色谱在相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品无干扰（见图1）。

图1 沙棘薄层色谱图Fig 1 TLC of Hippophae rhamnoides L.

2.2.2 益智仁薄层鉴别 按“2.2.1”项下方法制得供试品溶液。依据处方比例称取除了益智仁外的其他6 味药材，按“2.1”项下方法制得缺益智仁的阴性样品，再取缺益智仁的阴性样品1 mL，以供试品溶液处理方法得到益智阴性样品溶液。另取益智仁对照药材1 g，加入乙酸乙酯30 mL超声（功率200 W，频率40 kHz）提取30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加入甲醇1 mL 进行溶解，作为益智对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液、益智仁对照药材溶液、阴性样品溶液各5、13、10 μL，分别点于同一硅胶GF254 薄层板上，以石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸溶液进行显色，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。在益智仁薄层色谱图中，供试品溶液色谱与益智仁对照药材色谱在相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点清晰，无拖尾现象；且阴性样品色谱中无相同的斑点（见图2）。

图2 益智仁薄层色谱图Fig 2 TLC of Alpiniae Oxyphyllae Fructus

2.2.3 五指毛桃薄层鉴别 取益根调理口服液5 mL 按“2.2.1”项下方法制得供试品溶液。依据处方比例称取除了五指毛桃外的其他6 味药材，按“2.1”项下方法制得缺五指毛桃的阴性样品；再取缺五指毛桃的阴性样品5 mL，按照供试品溶液方法制备得到五指毛桃阴性样品溶液。另取补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 补骨脂素的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干；喷以氢氧化钾甲醇溶液进行显色，晾干后在365 nm 紫外灯下观察。五指毛桃薄层色谱图中，供试品溶液色谱与五指毛桃对照药材色谱在相应位置上显相同颜色的斑点，斑点清晰，并且阴性样品无干扰（见图3）。

图3 五指毛桃薄层色谱图Fig 3 TLC of Radix FiciHirtae

2.2.4 桑椹薄层鉴别 取益根调理口服液1 mL 按“2.2.1”项下方法制得供试品溶液。依据处方比例称取除了桑椹外的其他6 味药材，按“2.1”项下方法制得缺桑椹的阴性样品；再取缺桑椹的阴性样品1 mL，按供试品溶液处理方法制备桑椹阴性样品溶液。另取桑椹对照药材1 g，加乙酸乙酯30 mL 超声（功率200 W，频率40 kHz）提取30 min，滤液蒸干，残渣添加甲醇1 mL 进行溶解，制成桑椹对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254 薄层板上，以石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）为展开剂，展开，取出，晾干。在105℃加热至斑点显色清晰，取出放冷至室温，在365 nm 紫外灯和日光灯下进行观察。在桑椹薄层色谱图中，供试品溶液色谱在与桑椹对照药材色谱对应位置上，显相同颜色的清晰斑点，而阴性样品溶液色谱在相应位置无斑点（见图4）。

图4 桑椹薄层色谱图Fig 4 TLC of Mulberry

2.3 补骨脂素、鞣花酸含量测定研究

2.3.1 色谱条件 色谱柱：phenomenex-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；检测波长：254 nm；流动相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脱为0～16 min 时5%→28%B，16～30 min 时28%→55%B，30～45 min 时55%→85%B，45～50 min 时85%→100%B；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min－1；进样量：20 µL。

2.3.2 供试品溶液制备 精密量取5.0 mL 益根调理口服液，置于具塞锥形瓶中，精密加入25.0 mL 甲醇，精密称重；超声（功率200 W，频率40 kHz）处理30 min 后，放冷至室温，再次精密称重，补足重量并摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3.3 对照品溶液制备 精密称取鞣花酸对照品、补骨脂素对照品适量，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇稀释定容，摇匀后制得每1 mL 含补骨脂素0.0304 mg、鞣花酸0.1672 mg 的混合对照品溶液。

2.3.4 阴性样品溶液制备 依据处方比例称取除了五指毛桃外的其他6 味药材，按口服液制剂的制备工艺制得缺五指毛桃阴性样品，同法制得缺覆盆子阴性样品。分别精密量取五指毛桃阴性样品、覆盆子阴性样品5.0 mL，按“2.3.2”项下方法进行处理，分别得到缺五指毛桃阴性样品溶液、缺覆盆子阴性样品溶液。

2.3.5 系统适用性考察 分别精密吸取上述供试品溶液、混合对照品溶液、缺五指毛桃阴性样品溶液、缺覆盆子阴性样品溶液各20 µL，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，见图5；结果补骨脂素、鞣花酸成分与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数均大于20 000，阴性对照样品对补骨脂素、鞣花酸成分无干扰，方法专属性好。

图5 补骨脂素、鞣花酸的HPLC 色谱图Fig 5 HPLC of psoralen and ellagic acid

2.3.6 线性关系考察 精密吸取“2.3.3”项下混合对照品溶液适量，配制成具有6 个浓度梯度的混合对照品溶液，并分别精密吸取20 µL，注入高效液相色谱仪测定，分别记录峰面积。以进样量（µg）为横坐标（X）、对应峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果鞣花酸成分的回归方程为Y＝7.83×109X－3.96×105（r＝0.9993），在16.72～100.32 µg 内线性关系良好；补骨脂素成分的回归方程为Y＝3.53×109X＋1.63×104（r＝0.9999），在18.24～48.64 µg 内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 精密吸取“2.3.3”项下的混合对照品溶液20 µL，连续进样6 次，结果补骨脂素、鞣花酸峰面积的RSD分别为1.3%、1.5%（n＝6），表明仪器的精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 精密吸取“2.3.2”项下同一份供试品溶液（批次：20191029）20 µL，依据“2.3.1”项下色谱条件分别在第0、2、4、8、12、24 h 进样，结果补骨脂素峰面积的RSD为1.9%，鞣花酸峰面积的RSD为1.8%，表明在24 h 内供试品溶液的稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 平行量取同一批次口服液（批次：20191029）6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果口服液样品中的补骨脂素、鞣花酸成分的含量分别为0.2583 mg·mL－1、0.3871 mg·mL－1，RSD值分别为0.6%、2.0%（n＝6），说明该方法的重复性良好。

2.3.10 加样回收试验 精密量取同一批次口服液（批次：20191029）2.5 mL，平行量取6 份，加入鞣花酸（0.949 mg·mL－1）及补骨脂素（0.624 mg·mL－1）混合对照品溶液1.0 mL，置于具塞锥形瓶中，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果补骨脂素平均回收率为100.77%，RSD为2.1%；鞣花酸平均回收率为98.09%，RSD分别为2.0%。

2.3.11 样品含量测定 分别取6 批益根调理口服液样品，平行制备2 份，按“2.3.2”项下方法处理，进样测定，计算益根调理口服液中补骨脂素、鞣花酸的含量。结果见表1。

表1 鞣花酸及补骨脂素含量测定结果Tab 1 Content of ellagic acid and psoralen

3 益根调理口服液对小鼠免疫功能调节作用

3.1 受试动物

雄性ICR 小鼠80 只（SPF 级），体质量为（22±3）g [湖南斯莱克景达实验动物有限公司，使用许可证号：SYXK（湘）2015-0016]。小鼠于实验室适应性喂养1 周，室温（23±2）℃，明暗12 h 交替，自由饮食、摄水。

3.2 动物分组及给药

将雄性ICR 小鼠随机分为实验Ⅰ组、Ⅱ组，每实验组各40 只：实验Ⅰ组用于脾脏淋巴细胞活性测定，实验Ⅱ组用于巨噬细胞吞噬指数测定；同时将各实验组均分为4 小组，即益根调理口服液低、中、高剂量组及阴性对照组。其中益根调理口服液低、中、高剂量组分别按9.67 g·kg－1、19.33 g·kg－1、29.00 g·kg－1，以20 mL·kg－1灌胃，阴性对照组给予相应剂量的0.5%CMC-Na，每日灌胃1 次，连续30 d。实验期间，温度恒定、通风，所有小鼠自由饮食、饮水。

3.3 统计学方法

采用SPSS 16.0 进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，计数资料以率（%）表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3.4 脾脏淋巴细胞活性测定

实验前将第Ⅰ组小鼠进行称重并记录，末次给予受试样品1 h 后，无菌条件下取脾，并且制成单个细胞悬液。脾淋巴细胞活性应用ConA 刺激脾淋巴细胞分化增殖，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定；细胞增殖率（%）＝（实验组OD值－空白组OD值）/实验组OD值×100%。

与阴性对照组相比，各给样组动物平均体质量差异均无统计学意义（P＞0.05，见图6）。与阴性对照组相比，益根调理口服液高剂量组小鼠淋巴细胞增殖能力明显增加（P＜0.05，见图7）。

图6 益根调理口服液对ICR 小鼠（第Ⅰ组）体质量的影响Fig 6 Effect of Yigen conditioning oral liquid on body mass of ICR mice（group Ⅰ）

图7 益根调理口服液对ConA 诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力的影响Fig 7 Effect of Yigen conditioning oral liquid on conA-induced lymphocyte proliferation in mice

3.5 巨噬细胞碳廓清吞噬指数测定

实验前将第Ⅱ组小鼠进行称重并记录，末次给予受试样品1 h 后，按体质量从小鼠尾静脉注入20%印度墨汁（10 mL·kg－1）。分别于墨汁注入后2、10 min 从内眦静脉丛取血，并立即加入0.1%Na2CO3溶液，充分混匀，用酶标仪在600 nm 波长处测光密度值（OD）。采血后将小鼠处死，取肝脏和脾脏，分别称重，以吞噬指数表示小鼠碳廓清能力。吞噬指数a ＝体质量/（肝质量＋脾质量）×，K＝（lgOD1－lgOD2）/（t2－t1），OD1为2 min 吸光度值，OD2为10 min吸光度值；t为时间（min）。

与阴性对照组相比，各给药组体质量差异均无统计学意义（P＞0.05，见图8），益根调理口服液中剂量组小鼠碳廓清吞噬指数明显增加（P＜0.05），低剂量及高剂量组小鼠吞噬指数差异均无统计学意义（P＞0.05，见图9）。

图8 益根调理口服液对ICR 小鼠（第Ⅱ组）体质量的影响Fig 8 Effect of Yigen conditioning oral liquid on the body mass of ICR mice（group Ⅱ）

图9 益根调理口服液对ICR 小鼠吞噬指数的影响Fig 9 Effect of Yigen conditioning oral liquid on the phagocytic index of ICR mice

4 讨论

本研究建立了益根调理口服液的薄层鉴别，在沙棘、桑椹、益智仁薄层鉴别的过程中，分别考察了湿度、温度、不同展开剂以及不同薄层板对样品展开的影响，发现石油醚（60～90 ℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）作为沙棘、桑椹、益智仁鉴别的展开剂，斑点均明亮清晰，分离效果均较好，且无拖尾现象。

遵循中药质量标志物理论，对益根调理口服液质量标志物进行预测分析。该处方中黄精多糖是君药黄精的主要功效成分之一，其具有抗氧化、抗疲劳、调节免疫力、降血脂、护肝等药理作用[6-7]；灵芝多糖、桑椹多糖分别为臣药灵芝、桑椹的主要有效成分，均具有调节免疫、抗氧化、降血糖、降脂、抗衰老、护肝等药理作用[8-9]，多糖类成分较复杂，常用紫外分光光度法进行测定，而在测定过程中发现口服液中蔗糖甜味剂影响其总多糖的含量测定，因此不考虑黄精多糖、灵芝多糖、桑椹多糖作为该口服液功效成分的含量测定。五指毛桃为桑科榕属植物粗叶榕Ficus hirtaVahl.的根。本品性平，味甜辛，归肺、脾、胃、大肠、肝经，有益气健脾、祛痰化湿、舒筋活络之功[10]。处方中五指毛桃的特征性成分为补骨脂素成分，具有良好的抗氧化、抗衰老的药理作用以及具有调节免疫力的功能[11-12]。刘春玲等[13]通过实验研究发现五指毛桃能提高免疫功能低下小鼠的细胞免疫和体液免疫功能，对免疫功能具有调节作用。覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果实，始载于《神农本草经》，具有益肾固精缩尿、养肝明目的功效[14]。覆盆子中含量较高的有效成分为鞣花酸，具有良好的抗氧化以及调节免疫力的作用[15-16]。姜成哲等[17]通过观察鞣花酸对脾淋巴细胞增殖、自然杀伤细胞活性和Th1/Th2 细胞因子的影响，发现鞣花酸主要通过影响NK 细胞活性而起到一定的免疫调节作用。因此选择补骨脂素与鞣花酸作为益根调理口服液含量测定的特征成分。

现代药理研究表明，处方中的黄精多糖[18]、桑椹多糖[19]、灵芝多糖[20]、沙棘多糖[21]、补骨脂素[12]、鞣花酸[16]等成分均具有免疫调节作用。增强免疫力功能检验方法有很多，本课题组选择ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验及巨噬细胞吞噬指数实验对益根调理口服液增强免疫力的作用进行研究。细胞免疫主要是由T 淋巴细胞介导的一种特异性免疫反应，淋巴细胞转化率降低表示细胞免疫水平低下[22]。Con A 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验，其转化率常被用来衡量机体细胞免疫水平；T 淋巴细胞转化率低，意味着在外来因子的刺激下淋巴细胞的增殖反应降低，机体的免疫力下降[23]。非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分，巨噬细胞吞噬功能是反映非特异性免疫功能的常用指标之一。巨噬细胞为一类重要的免疫调节细胞，可通过吞噬病原体、细胞碎片、递呈抗原、分泌IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子诱导并调节特异性免疫应答[24]。有研究表明提高NK 细胞的杀伤活性与巨噬细胞的吞噬活性为增强免疫力的作用机制之一[25]。评价单核巨噬细胞的吞噬功能常采用碳廓清实验，当碳颗粒进入血液后，血液中的吞噬细胞便开始吞噬异物颗粒[26]。

本实验所建立的益根调理口服液质量标准科学合理、操作简便，且准确性、重现性较好，可用于益根调理口服液的质量控制；药效学初步研究表明益根调理口服液可能通过增强小鼠淋巴细胞增殖和吞噬功能的作用，从而增强机体免疫力，为进一步研究其免疫调节机制奠定基础。