盐酸小檗碱多晶型的制备、表征及其对自制片剂溶出行为的影响

闫富龙，祝宇龙，彭灿，2，3，4*（.安徽中医药大学药学院，合肥 23002；2.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，合肥 23002；3.中药复方安徽省重点实验室，合肥 23002；4.安徽省中医药科学院药物制剂研究所，合肥 23002）

近年来，随着对药物研究的深入，研究者发现在药物的药物成分、手性、结构、纯度等因素固定时，药物在质量和疗效上仍然存在着不稳定现象。经大量实验后发现了多晶型这一重要影响因素[1]。多晶型现象是指固体药物在结晶过程中因为条件的差异，分子在晶胞中对称规律的不同，使得药物分子之间、药物分子与溶剂分子之间相互作用力或结合方式以及空间结构等发生变化，从而使药物晶体出现两种或两种以上的空间群和晶胞参数[2-4]。不同的晶型具有不同的机械学、热力学、物理学和化学特性，尤其是对难溶性药物来说，不同晶型的转变会影响其在体内的溶解和吸收，进而影响药物的生物利用度、疗效，甚至产生不良反应，影响用药安全[5-7]。我国是一个仿制药大国，并且仿制企业繁多，同一品种可能被多家企业仿制，而药物的多晶型会直接影响药品的有效性、安全性和质量[8]。因此，固体药物多晶型的研究对药物的开发上市至关重要。

盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）是一种天然异喹啉类生物碱，又称为黄连素，主要来源于黄连、黄柏、三颗针等小檗科等4 科10 属药用植物[9-11]。目前盐酸小檗碱可以由植物提取和人工合成两种途径获得[12]，在临床上常用于治疗细菌性疟疾、肠胃炎等疾病[13-14]，效果显著。现代药理学研究证明，其还有降血脂[15]、降血糖[16]、抗肿瘤[17-19]和抗心律失常[20]等药理作用，具有广泛的应用前景。

目前国内外对于盐酸小檗碱片剂的研究，大部分集中于质检分析、含量测定以及辅料对盐酸小檗碱溶出度的影响等方面，而对其晶型的研究很少[21-23]。罗小飞等[24]发现不同溶剂中析出的盐酸小檗碱溶解度不同，经X 衍射分析发现盐酸小檗碱也存在多种晶型现象。晶型研究对于盐酸小檗碱药效发挥尤为重要，本文应用单一溶剂重结晶法制备盐酸小檗碱不同晶型，比较不同晶型自制片在不同溶出介质中的溶出行为，为改善盐酸小檗碱溶出与药物临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 试药

盐酸小檗碱对照品（含量：86.8%，批号：160901，中国食品药品检定研究院）；甲醇（北京百灵威科技有限公司）；冰醋酸、盐酸（国药集团化学试剂有限公司）；磷酸盐（天津市福晨试剂公司）；三乙胺（批号：20191130，上海润捷化学试剂有限公司）；蒸馏水。淀粉（批号：S116028）、羧甲基淀粉钠（CMS-Na，批号：C105666，阿拉丁有限公司）；聚维酮 K30（PVP K30，批号：190506，安徽山河药用辅料股份有限公司）；聚山梨酯 80（萨恩化学技术有限公司），硬脂酸镁（辽宁奥达制药有限公司）。所有辅料均为药用级辅料。

1.2 仪器

SmartLab3KW X-射线衍射仪（日本理学公司）；S-3700N 扫描电子显微镜（日本岛津公司）；Spectrum 400 红外光谱仪（英国PE 公司）；Mettler TGA/DSC1 热分析仪（瑞士梅特勒公司）；高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；超声波清洗机（YL060S，济南巴克超声波科技有限公司）；超纯水机（milli-Q Synt hesis，millipore）；十万分之一电子天平（BT25S，墨多利斯科学仪器有限公司）；循环水式真空泵；溶出试验仪（ZRS-8L，天津天大天发科技有限公司）；ZP29 旋转式压片机（上海天峰）；YD-1 片剂硬度测试仪（天津市国铭医药设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 晶型样品制备

本研究采用单一溶剂重结晶法制备盐酸小檗碱晶型样品，盐酸小檗碱原料药晶型设为晶A 型，其他新制备得到的晶型依次命名为晶B 型至晶F 型。取盐酸小檗碱原料药300 mg 于洁净容器中，少量多次加入总量为40 mL 的醋酸溶液、或100 mL 的乙酸乙酯溶液、或总量为25 mL 的二氯甲烷溶液、或总量为80 mL 的乙腈溶液、或总量为100 mL 的丙酮溶液，加热，体系温度均为20～100℃，磁力搅拌（速度控制在500～1200 r·min－1），反应1～5 h，使其完全溶解，得到黄色澄清溶液。溶液趁热过滤，滤液置于40～60℃真空干燥环境下挥发结晶，获得淡黄色粉末分别为盐酸小檗碱晶B型、盐酸小檗碱晶C 型、盐酸小檗碱晶D 型、盐酸小檗碱晶E 型、盐酸小檗碱晶F 型。

2.2 盐酸小檗碱不同晶型表征分析

2.2.1 晶体粉末扫描电子显微镜法 使用碳双面胶带将样品固定在黄铜桩上。然后设置电压为15 kV，电流为119 µA，拍摄不同晶型粉末微观照片。

如图1所示，5 种不同晶型的盐酸小檗碱粉末呈现不同的微观形状。晶B 型和晶F 型呈现两端渐变锋利趋势的针状，晶F 型呈现相比于普通针状更加狭长纤细的狭长针状；晶E 型为不规则块状晶型，晶体两端边缘无明显渐变锋利趋势，比较光滑；晶C 型为较为明显的柱状晶型，比表面积较大；晶D 型呈现为片状晶体，与晶C 型柱状晶型较为相似，但侧面可以看出特别薄，其比表面积比柱状小。

图1 盐酸小檗碱晶5 种晶型的扫描电子显微镜图Fig 1 SEM image of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.2 差示扫描量热法（DSC） 精密称取不同晶型盐酸小檗碱粉末样品5～10 mg，置于40 μL 标准Al2O3坩埚中，铺匀后压盖，放入差示扫描量热仪中，以40 μL 标准Al2O3空坩埚为参比，在温度范围0～240℃，升温速率10 ℃·min－1的条件下进行分析，记录DSC 曲线。

如图2所示，样品在二次升温过程中无特征吸收峰，经观察样品升温到240℃和300℃时均已完全碳化，所以185℃左右为盐酸小檗碱粉末的熔点温度，与相关文献记载的190℃相符。除熔点吸收峰外，晶B 型和晶C 型DSC 图谱中只存在100℃左右的吸收峰，说明该晶型盐酸小檗碱粉末中只存在游离水；晶B 型和晶C 型DSC 图谱中只存在150℃左右的吸收峰，说明该晶型盐酸小檗碱粉末中只存在结合水；晶F 型在图谱上存在100℃左右和150℃左右两个特征吸收峰，说明多晶型盐酸小檗碱粉末中存在游离水和结晶水。由于制备的盐酸小檗碱粉末在实验前已干燥5 h，说明该晶型粉末具有较强的吸湿性。

图2 盐酸小檗碱5 种晶型的DSC 图谱Fig 2 DSC spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.3 傅里叶变换红外光谱法 压力作用因素可能会导致药物晶型发生改变，本实验采用衰减全反射法（ATR）红外光谱法，药物粉末直接进样。光谱范围：6000～650 cm－1，分辨率：4.00 cm－1，扫描次数：16 次。

采用红外光谱法对5 种晶型盐酸小檗碱样品进行表征，其红外吸收光谱如图3所示。5 种晶型在3649、3324、3047、2162、1505、1140、1109、1066、1018 cm－1等处均具有红外光谱特征峰，其中红外光谱特征峰的允许偏差为±2 cm－1。比较盐酸小檗碱不同晶型样品红外吸收峰发现，晶C型、晶D 型、晶E 型和晶F 型在3549 cm－1处无明显吸收峰，表明可能发生了开环反应；晶B 型和晶C 型在1705 cm－1处存在吸收峰，表明存在羧基，可能来源于醋酸的羧基或乙酸乙酯的酯基。

图3 盐酸小檗碱5 种晶型的红外图谱Fig 3 Infrared spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.4 X 射线粉末衍射法 称取一定量的5 种晶型样品，进行粉末X 射线衍射检测。检测条件：使用CuKα辐射在40 mA 和40 kV 下运行，并在衍射束上配备石墨单色仪，以收集X 射线衍射图案；在3°≤2θ≤80°的范围内以步长0.01°记录XRD 图案，每步至少采集1000 个计数。平均晶体尺寸通过Scherrer 方程估算，其中积分宽度已针对仪器加宽进行了校正。仪器轮廓加宽源自对标准样品获得的XRD 数据的拟合。

结果如图4所示，盐酸小檗碱5 种晶型在X射线粉末衍射图谱上均有一定的差异。晶B 型盐酸小檗碱在2θ＝8.92 处出现了强衍射峰，且强度较高，并在2θ＝47.3 处出现了为其他晶型所不具有的散射峰。晶C 型盐酸小檗碱在2θ在8～10范围内出现了双强峰，晶D 型盐酸小檗碱粉末在2θ为25.4、26.3 时无明显散射峰，而在2θ为16.9、17.7 时处存在散射峰，表明晶D 型可能发生了键位变化或晶型变化。晶E 型盐酸小檗碱在为2θ为10.1、11.3、11.8 处存在散射，说明晶E 型与其他晶型晶相不同，而晶F 型盐酸小檗碱13.0～15.0内没有出现衍射峰这与其他晶型不相同。X 射线衍射结果说明5 种盐酸小檗碱晶型各不相同。粉末X 射线衍射分析法可用于不用晶型物质鉴别，是盐酸小檗碱晶型鉴定的有效分析方法。

2.3 盐酸小檗碱片剂制备

本实验采用湿法制粒法，先将5 g 不同晶型盐酸小檗碱粉末过100 目筛，置于研钵中，分别加入2.2 g 淀粉和3.55 g 含有聚山梨酯80 的80%乙醇溶液，充分搅拌均匀之后，制软材，过80目筛，放置托盘中，105℃下干燥2 h，最后加入70 mg 羧甲基淀粉钠和50 mg 硬脂酸镁，混匀，随之压片（盐酸小檗碱自制片规格为0.1 g/片）。然后对盐酸小檗碱自制片进行了片剂质量检查，包括片剂外观、片重差异和片剂硬度等检查。

从5 种晶型盐酸小檗碱自制片中各随机选择6 片进行观察，外观检查结果如表1所示。片剂表面略有黑点出现，经过分析，确定黑点是由辅料颜色加深造成的，这对片剂质量没有影响。由于晶E 型粉末在压缩时容易折断，难以制成片剂，可能与晶E 型的不规则块状有关。所以后续研究中，晶E 型将不再纳入研究范围。从4 种晶型盐酸小檗碱自制片中各随机选择20 片进行准确称重，计算差异。盐酸小檗碱粉末自制片片重差异见表2，差异范围在90%～120%，符合药典标准。从4 种晶型盐酸小檗碱自制片中各随机选择6 片，用片剂硬度计测定片剂硬度，结果如表3所示，各片剂平均硬度在30～60 N，符合片剂标准。综合所上，晶E 型盐酸小檗碱粉末不符合压片要求，其他4 种晶型粉末所制片剂均符合标准。

表1 5 种晶型盐酸小檗碱自制片剂外观检查(n ＝6)Tab 1 Appearance of 5 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n ＝6)

表2 4 种晶型盐酸小檗碱自制片片重差异(n ＝6)Tab 2 Weight of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets(n ＝6)

表3 4 种晶型盐酸小檗碱自制片硬度测试(n ＝6)Tab 3 Hardness test of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n ＝6)

2.4 高效液相法测定溶出度

采用HPLC 系统，色谱柱为Unitary C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为36 ℃。流动相为0.2%三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸溶液-乙腈（65∶35，V/V），以1.0 mL·min－1的流速进行洗脱。检测波长为346 nm，进样量为10 μL。

取盐酸小檗碱对照品用甲醇溶液稀释至1 mg·mL－1作为对照品储备液在4 ℃下保存。取对照品储备液逐级稀释（5～100 µg·mL－1）后测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X）建立标准曲线，Y＝44.03X＋9.982，R2＝0.999。

同时，基于课题组前期的研究[25]，考察所建立HPLC 方法的方法学，包括特异性、线性、精密度、准确度、重复性和加样回收率，结果均符合要求。

2.5 药物溶出度实验

分别取盐酸小檗碱自制片各6 片，以超纯水，pH 4.5 醋酸缓冲液，pH 6.8 磷酸盐缓冲液为溶出介质，参照2015年版《中国药典》盐酸小檗碱片溶出度测定法（篮法）进行考察。溶出介质为1000 mL，转速为120 r·min－1，温度设置为（37±2）℃，分别在第5、10、15、20、30、45、60、120 min 取样，用微孔滤膜过滤后，进样。依据CFDA 颁布的《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》，连续两点溶出量均达85%以上，且差值在5%以内，可作为考察截止时间点选择的依据。从图5a 中可以看出，在纯水溶出介质中，晶F 型盐酸小檗碱自制片较快溶解，能有良好的溶出行为；晶D 型自制片在90 min 内累计溶出量达到85%，晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介质中溶出较慢。4 种自制片剂在醋酸缓冲液溶出介质的溶出曲线如图5b 所示，晶B 型、晶D 型和晶F 型自制片能在较短时间内达到85%溶出量，表现出良好的溶出行为，而晶C型自制片溶出较慢。如图5c 所示，晶D 型和晶F 型在磷酸缓冲液溶出较快，具有良好的溶出行为；晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介质中溶出较慢；此外，晶D 型自制片溶出曲线在20～60 min 有一定的下降趋势，可能是晶D 型盐酸小檗碱发生了一定程度的降解行为。综合考虑4 种不同晶型自制片在3 种溶出介质中的溶出行为，晶F 型自制片在所有介质中都有较快的溶出行为，而晶C 型自制片都表现出较慢的溶出，晶B 型和晶D 型自制片在3 种溶出介质中表现出不一致的溶出行为。

图5 4 种晶型盐酸小檗碱片在超纯水（a）、醋酸盐缓冲液（b）、磷酸盐缓冲液（c）的溶出曲线Fig 5 Dissolution curve of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets in ultrapure water （a）， acetate buffer （b）and phosphate buffer （c）

3 讨论

药物多晶型现象对于药物的研发具有极其重要的意义，约70%临床使用的药物为固体口服制剂，而且50%以上固体药物存在多晶型现象。不同晶型药物对药物的吸湿性、稳定性、生物利用度、药效以及安全性等产生较大的影响[26]。由此固体药物选择一种合适的存在形式对于药物应用显得尤为重要。盐酸小檗碱在临床上以盐酸小檗碱片为主要用药剂型，本研究中采用单一溶剂重结晶法制备了盐酸小檗碱5 种晶型，从晶型微观、红外光谱、热分析以及物质结构分析等多个方面对盐酸小檗碱多晶型进行表征，可以直观且准确地描绘出盐酸小檗碱多晶型在各个方面的差异，为盐酸小檗碱多晶型后续研究提供数据参考。

本实验在前期优化片剂制备工艺的基础上，均采用最佳工艺条件进行制片，设置原料药晶型为实验设计单一变量，考察原料药晶型因素对于片剂溶出度的影响。并依据《普通口服固体制剂溶出曲线测定与指导原则》，根据药物的理化性质，充分考虑体内环境因素的影响，应选择不同pH 的溶出介质进行溶出度的考察。实验中为模拟体内胃肠道环境，纯水、pH 1.2 的盐酸溶液、pH 4.5 的醋酸盐缓冲液和pH 6.8 的磷酸盐缓冲液被选择为4 种不同pH 的溶出介质。因在pH 1.2 的盐酸溶液介质中，盐酸小檗碱的稳定性不好，且在5～100 μg·mL－1线性关系不符合要求，故后续研究中剔除了pH 1.2的盐酸溶液的溶出介质。基于多晶型盐酸小檗碱的溶出行为结果，表明晶F 型自制片在所有介质中都有较快的溶出行为，而比表面积较大的晶C 型自制片在各介质中都表现出较慢的溶出。溶出速度从快到慢依次为针状、片状和柱状，狭长针状的溶出速度快于针状。

综上所述，本文从药物晶型表征以及研究其对片剂溶出度的影响，发现晶型单晶比表面积对药物溶出行为产生显著的影响。后续研究可关注药物晶型、粒径、形貌等属性对溶出行为的影响，以更加精准地控制原料药质量，并根据临床对药物释放速度的需求，选择不同晶型的原料药制备所需制剂。