嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症SUMO特异性蛋白酶3表达降低促进替代激活巨噬细胞极化△

暴喜明 周争 李吉平

(上海交通大学医学院附属仁济医院耳鼻咽喉科 上海 200127)

近年来，随着对慢性鼻黏膜炎症病理的研究，有学者提出对慢性鼻黏膜炎症根据病理进行分型，其中有代表性的是按照组织内嗜酸性粒细胞的浸润程度分为嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症和非嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症[1]。而通过比较嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症和非嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症的病理特点，可以发现前者炎性细胞浸润更显著，水肿更明显，呈现 Th2极化现象，白细胞介素 -4(interleukin-4，IL-4)、IL-13含量明显增高[2-3]。有文献[4]表明，替代激活巨噬细胞(M2巨噬细胞)与Th2细胞免疫反应产生的IL-4、IL-13关系密切。有研究[5]表明，当局部组织遭遇炎症刺激时，血液中的单核细胞会快速聚集在局部组织内，分化成巨噬细胞激活免疫反应并分泌相应的炎症因子。在特定的微环境下，单核-巨噬细胞可活化为2种对立的极端表型，分别为经典激活巨噬细胞(M1巨噬细胞)以及M2巨噬细胞。M1 巨噬细胞经 γ干扰素 (interferon-γ，IFN-γ)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导产生，高表达肿瘤坏死因子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等细胞因子，参与胰岛素抵抗、杀死细胞内寄生虫和肿瘤细胞等免疫反应。M2经IL-4、IL-13、糖皮质激素(glucocorticoid)等诱导产生，高表达甘露糖受体(mannose receptor，CD206)、精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和炎症区分子(found in inflammatory zone 1，Fizz-1)等细胞因子，参与Th2细胞免疫反应、促进组织修复和抑制肿瘤生长等免疫反应[5-7]。近年来，有大量研究证实M1/M2的平衡破坏对肺纤维化[8]、脑动脉瘤[9]、神经退行性疾病[10]等多种疾病的发展和转归起到了重要的影响。单核-巨噬细胞的极化方向在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症中可能起到至关重要的作用。

SENP(SUMO-specific protease)是一类可以使与靶蛋白共价连接的泛素化小分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)解离的蛋白质[11]。其中SUMO化(SUMO lation)是一种蛋白质翻译后修饰形式，是SUMO通过酶途径偶联到目标蛋白中赖氨酸残基的过程[12]。SUMO是一个可逆性的修饰蛋白，SENP通过改变SUMO与靶蛋白结合的状态进而参与调节靶蛋白的功能[13]。SUMO共有4种分子，其中SUMO2、SUMO3可以被SENP家族成员之一的核仁蛋白SENP3特异性解离。近年来有研究表明SENP3可以在活性氧(reactive oxygen species，ROS)的刺激下大量积聚，提示SENP3可能是应答氧化应激的关键分子[14]。另外，Lao等[15]的研究发现SENP3对LPS诱导的巨噬细胞极化有促进作用。因而可以推测SENP3是连接机体氧化应激反应与巨噬细胞介导的炎症反应的关键分子之一。而目前没有研究证明SENP3对IL-4、IL-13诱导的巨噬细胞极化有何种影响。由于大量文献报道在Th2细胞免疫反应下的嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症中发现IL-4、IL-13，因而本实验围绕嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症，构建SENP3单核细胞特异性敲除的小鼠，并通过鸡卵清蛋白(ovalbumin， OVA)诱导的嗜酸性粒细胞浸润变应性鼻炎(allergic rhinitis， AR)动物模型，探讨SENP3通过影响巨噬细胞的极化方向在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症发生、发展中的作用，以期进一步阐释调控嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症发生和进展的潜在机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 8周雄性C57 BL/6小鼠，体重18~25 g，基因型为Senp3 flox/flox和Senp3 flox/flox Lyz2-cre(Senp3 cKO)，实验用SENP3基因敲除鼠为Senp3 flox/flox 和 Senp3 flox/flox Lyz2-cre (Senp3 cKO) 小鼠交配所得，对照组为同窝Senp3 flox/flox小鼠，基因敲除方法与来源如文献[15]所述。所有实验用鼠均饲养在上海交通大学医学院SPF级动物房，可以自由获得食物和水。所有动物实验计划严格按照中华人民共和国科学技术部颁发的《实验动物爱护和使用指南》的规定进行。本方案经上海交通大学医学院动物保护与使用制度委员会批准(许可证号：A-2019-010)。

动物模型的鼻部标本提取：在连续滴鼻12周、最后1次鼻腔激发30 min后脱颈处死；处死后予以心脏灌注20 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗以及20 mL 4%多聚甲醛固定；小鼠鼻标本取材根据Dunston等[16]报道，剥开头皮、切断颧骨及下颌骨后于眼眶后上部分离鼻部。原代骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage，BMDM)提取和诱导方式如Weischenfeldt等[17]报道，孵育方法略有改变。具体如下：在脱颈致死后分离股骨与胫骨，剥离肌肉后用无菌眼科剪开放两侧干骺端，将1 mL注射器用α-MEM(Gbico，12571-063，USA)从一端干骺端向另一端冲出，经70 μm MACS Smartstrainer(Miltenyi，130-098-462，GER)过滤并孵育。

1.2 临床标本收集 患者来自本院耳鼻喉科。本院伦理委员会批准了该研究，并在纳入研究前征得所有参与者的知情同意。依据中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组2018年制订的《中国慢性鼻黏膜炎症诊断和治疗指南》，本研究根据组织内嗜酸性粒细胞浸润数目及外周血嗜酸性粒细胞百分比双重诊断标准纳入10例嗜酸性粒细胞浸润性慢性鼻黏膜炎症手术患者，取下标本进行石蜡包埋、切片并采用免疫荧光染色进行分析。鼻黏膜组织取自鼻内镜手术，鼻息肉旁黏膜组织、无息肉患者的钩突黏膜组织。所有患者均排除哮喘、阿司匹林不耐受三联综合征，并于手术前4个月未使用抗生素、糖皮质激素治疗。

1.3 方法

1.3.1 BMDM培养 方法类似文献[17]报道。在含有α-MEM、10%胎牛血清(Hyclone，sv30087.03，USA)、小鼠巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF；Sino Biological，511112-MNAH，中国)50 ng/mL下孵育，每2 d更换细胞培养液，培养7 d成熟后种于6孔板中，在第7天用 IL-4(Sino Biological，51084-MNAE，中国 )20 ng/mL、IL-13(Sino Biological，50225-MNAH，中国)10 ng/mL共同刺激48 h。

1.3.2 嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症动物模型建立 方法如Kim等[18]和Wang等[19]所述。本实验为Th2细胞免疫反应的嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症动物模型，为了排除细菌或真菌对巨噬细胞和鼻息肉生成的不确定性因素，动物模型的建立全程在SPF级动物房进行，且鼻腔未用任何细菌或真菌定植。动物模型建立小鼠共3窝。Senp3 flox/flox (Senp3 fl/fl) 小鼠25只，Senp3 flox/flox Lyz2-cre(Senp3 CKO) 小鼠25只；每组小鼠滴入OVA 15只，滴入PBS 10只。

致 敏 期：100 μL PBS溶 解 OVA ( SIGMA，A5503-1g，USA)腹腔注射 75 μg/只，Imject™ Alum Adjuvant(Thermo Scientific，77161，USA)50 μL/只，隔天1次，共7次。

激发期：25 μg/μL OVA滴鼻，每天1次，持续12周，每个鼻孔10 μL，滴鼻后将小鼠倒置5 min防止OVA流入气道。

每次激发10 min后观察小鼠症状，50只小鼠均出现抓鼻、抓耳、打喷嚏的行为，症状学评分均达到AR造模标准。嗜酸性粒细胞特异性LUNA染色均可观察到鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞浸润。

1.3.3 免疫荧光染色 患者鼻黏膜组织巨噬细胞及SENP3蛋白免疫荧光共定位染色、动物模型小鼠鼻部标本巨噬细胞免疫荧光染色。标本经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋，分别用CD68抗体1:2 000(Service，GB13067-M-2，中国)、CD206抗体1:200(Service，GB11062， 中 国 )、SENP3抗 体 1:5 000(5591S，CST，USA)4 ℃避光孵育过夜后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠或兔抗体1:500(Service，GB2330，中国)室温孵育50 min，再用FITC、CY3、1:200的 594山 羊 抗 兔 荧 光 二 抗(Service，中国)避光室温孵育10 min。最后DAPI(Service，G1012，中国)复染后镜检、拍照，DAPI紫外激发波长330~380 nm，发蓝光；FITC激发波长465~495 nm，发绿光；CY3激发波长510~560 nm，发红光；594激发波长594 nm，发玫红光。小鼠鼻部标本免疫荧光染色为连续切片染色，切片距离为3~5 μm。标本处理过程略有不同，经4%多聚甲醛固定后，用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙2周，再用石蜡包埋。巨噬细胞免疫荧光共定位染色分别用F4/80(Service，GB11027，中国)、CD206(Service，GB11062，中国)染色。用正置荧光显微镜(NIKON ECLIPSE C1，JAP)观察，成像系统(NIKON DS-U3)摄影。

1.3.4 LUNA染色 方法如Wang等[20]所述。Weiger铁苏木精(0.005%的苏木精酸和0.6%的氯化铁溶于2%的盐酸)与比布里希猩红工作液(比布里希猩红和0.1%的酸性品红在1%的乙酸中孵育5 min) 9:1配制染色 5 min，继而用 1% 盐酸乙醇溶液分化，再以0.5% 的碳酸锂溶液浸泡 1 min，水洗、脱水、透明封片。光学显微镜下观察，被特异性染色呈猩红色的细胞为嗜酸性粒细胞。

1.3.5 流式细胞定量分析 BMDM流式细胞定量分析。将培养后的BMDM对照组种于六孔板内，将六孔板中的细胞用细胞刮刀小心刮下，在洗涤重选后的细胞悬液加入1:50 Fc Block(BD Pharmingen，553141，USA)4 ℃封 闭5 min后 加 入F4/80抗体 1:100(eBioscience，48-4801-82，USA)室 温 避光孵育30 min，用破膜试剂盒(BD Pharmingen，554714，USA)于4 ℃破膜20 min，再用 CD206(BD Pharmingen，141710，USA)室温光孵育30 min。洗涤后上机(Beckman CytoFlex 流式细胞仪)检测。

1.3.6 蛋白免疫印迹法 将培养后的BMDM对照组种于六孔板内，每个孔用150 μL的4×十二烷基硫酸钠(SDS)提取蛋白，用NanoDrop进行蛋白定量，用10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶制备试剂盒(PG112，EpiZyme)配制凝胶，每孔上样5~10 μL，两侧加入5 μL Prestained Protease Ladder(Thermo Scientific，00594048，USA)，恒定电压90 V进行电泳后，恒定电压90 V转膜90 min，5%脱脂奶粉封闭后用SENP3抗体1:1 000(CST，5591S，USA)、β-actin抗体 1:1 000 ( SIGMA，MAB8929，USA )4℃孵育过夜。5%脱脂奶粉分别溶解抗SENP3抗体1:5 000(Jackson ImmunoResearch，111-035-003，USA)、抗 β-actin 抗 体 1:5 000(Jackson ImmunoResearch，115-035-003，USA)孵育后，β-actin显影用ECL显色液(Pierce，34580，USA)，SENP3用超敏显色液(Merck，wbkls0500，GER)显色。

1.4 统计学处理 数据分析采用SPSS 23.0软件。流式细胞分析采用CytExpert数据采集及分析软件。蛋白免疫印迹法采用Image J定量分析。采用多重t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 巨噬细胞SENP3敲除的嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症小鼠鼻黏膜中M2巨噬细胞数量增加 为了探究SENP3在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症中对巨噬细胞极化的作用，我们利用SENP3 cKO小鼠(n=10)和SENP3 fl/fl小鼠(n=10)进行PBS连续滴鼻从而建立空白对照组的动物模型(图1A、B)；利用SENP3 cKO小鼠(n=15)和SENP3 fl/fl小鼠(n=15)进行OVA连续滴鼻从而建立嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症的动物模型(图1C、D)。为了达到长期、稳定的嗜酸性粒细胞浸润的炎症反应，我们将滴鼻时间设定为12周。模型建立后，采用免疫荧光染色的方法对CD206抗体进行特异性标记，即M2巨噬细胞。分析后发现OVA连续滴鼻12周后的SENP3 cKO小鼠鼻黏膜中的CD206+细胞数量较SENP3 fl/fl小鼠显著增加，差异有统计学意义[(13.750±5.115) 个vs.(7.367±4.197)个；P=0.000 8；图1E)]。数据经3个实验员随机选取3个不同视野进行计数后取平均值，最终数据以各组平均值±标准差表示。

图1 SENP3 cKO组和SENP3 fl/fl组小鼠鼻黏膜CD206+细胞 A～D分别为Senp3 f1/f1对照小鼠、Senp3 cKO对照小鼠、Senp3 f1/f1实验小鼠和Senp3 cKO实验小鼠；E为4组CD206+细胞数量比较。统计分析方法采用t检验，*示P<0.001。

2.2 SENP3敲除的BMDM在IL-4和IL-13的刺激下M2巨噬细胞的比例升高 为了进一步明确敲除SENP3在M2巨噬细胞极化过程中发挥的作用，我们分别从单核-巨噬细胞系SENP3 cKO小鼠和Senp3 fl/fl小鼠的腿骨上提取BMDM，在50 ng/mL M-CSF的诱导培养7 d后，用20 ng/mL IL-4和10 ng/mL IL-13刺激48 h进行诱导极化。用流式细胞仪定量分析，经过F4/80+圈门后，以CD206+细胞特异性标记M2巨噬细胞。结果显示，在加入20 ng/mL IL-4和10 ng/mL IL-13后，Senp3 fl/fl小鼠(图2A、B)与Senp3 cKO小鼠(图2C、D)CD206+细胞比例均增加，但Senp3 cKO小鼠鼻黏膜中CD206+细胞比例增加较Senp3 fl/fl小鼠显著升高(图2E)。每个样本记录至少20 000个细胞。

2.3 巨噬细胞替代激活过程中SENP3表达量降低尽管在体外SENP3完全敲除的状态下M2巨噬细胞显著增加，但生理状态下SENP3并未完全敲除，其在M2巨噬细胞中如何发挥作用我们依然不得而知。因此，我们从Senp3 fl/fl小鼠腿骨中提取、孵育并诱导成熟BMDM，经20 ng/mL IL-4和10 ng/mL IL-13分别刺激0、1、2、4 h后采用蛋白免疫印迹法对SENP3蛋白进行定量分析(图3A)。结果发现，在加入IL-4和IL-13后，SENP3表达量在2~4 h明显下降(P=0.000 8；图3B)。

图3 Senp3 fl/fl组小鼠BMDM发生替代激活时SENP3的表达量 A示经20 ng/mL IL-4和10 ng/mL IL-13分别刺激0、1、2、4 h后蛋白定量分析；SENP表达量在2～4 h明显下降，统计分析方法采用t检验，*示P<0.001。

2.4 巨噬细胞内的SENP3表达量下降促进了M2巨噬细胞的极化 为了探究SENP3在人体内是否对M2巨噬细胞具有相类似的影响，我们用10例嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症患者的鼻黏膜组织进行石蜡包埋病理切片，采用免疫荧光共定位分析。可以发现，SENP3-的CD68+细胞表达CD206的比例更高(图4A~D)，SENP3+的CD68+细胞不表达CD206的比例更高(图4E~H)。除此之外可以发现，SENP3-CD68+CD206+细胞较SENP3+CD68+CD206+细胞更多，差异具有统计学意义[(4.090±1.693) 个vs.(0.540±0.711)个；P<0.000 1；图4I)]。数据经3个实验员随机各选取3个不同视野进行计数后取平均值，最终数据以各组平均值±标准差表示。

图4 嗜酸性粒细胞性浸润性鼻黏膜标本中SENP3、CD68、CD206免疫荧光共定位 A~D示 SENP3–的CD68+细胞表达CD206的比例更高；E~H示SENP3+的CD68+细胞不表达CD206的比例更高；I示 SENP–CD68+CD206+细胞较SENP3–CD68+CD206+细胞更多，统计分析方法采用t检验，*示P<0.001。

3 讨论

3.1 SENP3的下调促进M2巨噬细胞极化 在本实验中，我们发现敲除SENP3对巨噬细胞替代激活有一定的促进作用，提示可能存在SUMO2/3的去SUMO化修饰参与巨噬细胞替代激活的过程。在对与SENP3同源分子SENP1的相关研究中，SENP1敲除可以促进巨噬细胞替代激活[21]。发现KLF4蛋白的SUMO-1修饰可以促进巨噬细胞替代激活，而SUMO-1特异性SUMO蛋白酶SENP1的敲除，使得KLF4蛋白倾向与SUMO-1结合，从而改变了巨噬细胞的极化方向。这与我们的研究结论相一致。根据检索，既往对M2巨噬细胞的研究均为基于对信号转导和转录活化因子6(signal transducers and activators of transcription，STAT6)转录水平的相关研究[22]。在这一过程中，Th2细胞产生大量IL-4和IL-13。IL-4与 IL-4受体 α(IL-4 receptor-α，IL-4Rα)形成 I和Ⅱ型复合物，同时IL-4Rα还通过招募IL-13Rα1形成Ⅱ型复合物，Ⅰ型和Ⅱ型复合物通过JAK通路刺激STAT6的磷酸化，从而巨噬细胞产生替代激活这一极化方式来应答Th2细胞免疫反应[23-24]。尽管有大量关于M2巨噬细胞极化机制的相关研究，但目前还没有关于M2巨噬细胞极化过程中翻译后修饰的报道。因而本实验结果从翻译后修饰的角度对进一步寻找针对巨噬细胞替代激活过程中重要转录因子潜在SUMO2/3位点具有重要意义。

3.2 M2巨噬细胞促进鼻息肉形成 有文献[25]报道，慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻黏膜中M2巨噬细胞显著增高，提示鼻息肉的形成与M2巨噬细胞极化产生的组织重塑密切相关。该研究阐明了在慢性鼻黏膜炎症的进展中，金黄色葡萄球菌感染对巨噬细胞极化为M2巨噬细胞进而形成鼻息肉具有促进作用。除此以外，有大量文献报道了M2巨噬细胞对促进鼻息肉形成的机制研究。其中起到主要作用的是M2巨噬细胞高表达转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)。TGF-β 通 过 上 调 核 因 子 -κB(nuclear factor κB，NF-κB)、p38 等通路引起胶原蛋白合成大于分解,引起细胞外基质聚积,促进组织纤维化进而息肉样变[20,26]。TGF-β还可通过引起血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的增加进而加剧血管重塑促进息肉形成[27]。除此以外，M2巨噬细胞还可通过改变血管通透性[28]和调节凝血机制促进鼻息肉的形成[29]。

3.3 巨噬细胞在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症中可能的作用 根据以往对巨噬细胞极化的相关研究基本达成的共识，M1巨噬细胞为促炎型的巨噬细胞，M2巨噬细胞为抑炎型的巨噬细胞[5，30]。由于机体内M1/M2平衡的打破从而引起免疫功能紊乱。由于SENP3对外界造成的氧化应激反应十分敏感，因而类似SENP3介导的可逆的SUMO化反应可能是打破M1/M2平衡的重要因素。在Lou等[31]的研究中，由于致敏因素的存在，AR患者的M2巨噬细胞与症状严重程度密切相关，提示巨噬细胞参与机体的免疫状态中。然而，巨噬细胞存在的交替激活方式及其对炎症状态的改变可能对炎症的持续和转归具有重要的意义，有待进一步探索。