利用猪角膜脱细胞基质行板层角膜移植手术治疗感染性角膜炎的临床研究

范祥雨 黄霏霏 张朝然 徐建江 项俊

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)

感染性角膜炎是我国主要的致盲性角膜病[1-2]。对于药物治疗无效的感染性角膜病变，角膜移植手术是控制感染和重建眼表的必要手段[3-4]。对于病灶局限于前或中基质的感染性角膜炎患者，深板层角膜移植术(deep lamellar keratoplasty，DALK)显示出其独特优势[5-6]。目前，角膜移植手术的供体材料主要来源于同种异体角膜，而捐献的供角膜匮乏严重阻碍了角膜盲患者的复明[7]。因此，近年来各类新型角膜替代物材料一直是研究者关注的热点。生物工程角膜是将猪角膜组织经脱细胞、去抗原和病毒等生物技术处理后制成的角膜基质材料，可在一定程度上替代人角膜应用于临床，缓解供体紧缺的局面。本研究采用该材料对感染性角膜病患者行板层角膜移植术并观察其术后临床效果，现将已完成观察的15例患者结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料 采用前瞻性系列病例观察的研究设计，收集2018年5月~2019年4月在本院就诊、经药物治疗无效的15例感染性角膜炎患者，其中女性5例、男性10例；年龄41~71岁，平均(58.13±9.40)岁。12例确诊为真菌性角膜炎，2例临床诊断为病毒性角膜炎，1例确诊为铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)性角膜炎。纳入标准：年龄18~80岁；诊断为感染性角膜病者；按病因或经验正规用药1~3 周，感染未得到控制的患者；病灶位于瞳孔区，范围为 4.0~8.5 mm，累及角膜基质，但尚未累及后弹力层角膜者；术前最佳矫正视力(best-corrected visual acuity，BCVA)＜0.05者。排除标准：全身情况差，不能耐受手术者；角膜穿孔严重者；严重干眼症或眼睑闭合不全者；严重的过敏体质或对试验材料过敏者；合并有感染性眼内炎者，单眼患者或对侧眼视力丧失者。试验已通过复旦大学附属眼耳鼻喉科医院医学伦理委员会批准，所有患者术前均签署手术知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 材料 生物角膜植片由广州悦清再生医学科技有限公司提供，仅供本次临床研究应用。

1.2.2 手术步骤 选择一次性角膜环钻，环钻直径至少大于病灶0.5 mm，钻切深度约为角膜厚度的3/4，从周边开始进行角膜剖切。如一次剖切不能切除病灶，可进行多次剖切直至植床透明。取400 μm厚的生物角膜植片，直径比植床大0.25~0.5 mm，10-0尼龙线间断缝合12~16针。确诊为真菌感染者，术中使用伏立康唑溶液冲洗植床。术后根据病情需要予其局部使用他克莫司滴眼液，4次/d；病毒性角膜炎使用更昔洛韦凝胶，4次/d；铜绿假单胞菌性角膜炎使用左氧氟沙星滴眼液和妥布霉素滴眼液，1次/h；真菌性角膜炎予以局部使用0.5 % 伏立康唑滴眼液(院内自制制剂)及5 % 纳他霉素滴眼液(那特真，Alcon公司)0.5~1 h 1次。观察2~4周后如无感染复发，局部加用妥布霉素地塞米松滴眼液(典必殊，Alcon公司)滴眼3~4次/d。

1.2.3 观察指标 于术后1 d、1周、1个月、2个月、3个月和6个月时复诊。复诊时行BCVA、裂隙灯显微镜、眼压、眼前节光学相干层析成像（optical coherence tomography，OCT；Tomey，日本 ) 及共聚焦显微镜(ZEISS，德国)检查。评分标准：①角膜植片透明度，0级为透明；1级为轻度混浊，能看清虹膜纹理；2级为中度混浊，部分虹膜纹理不清；3级为严重混浊，虹膜纹理完全看不清。②角膜新生血管，0级为无新生血管；1级为受体角膜出现新生血管；角膜植片无新生血管；2级为角膜植片周边出现新生血管，但未累及中央区；3级为角膜植片中央出现新生血管。

1.3 统计学处理 脱盲率计算公式：脱盲率=BCVA≥0.05的病例数/总病例数。为了便于统计分析，将BCVA转化为标准logMAR视力。采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。手术前后不同时间点的角膜植片透明度和新生血管评分的总体差异比较采用Friedman检验，比较患眼术前和术后的视力均值采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后感染控制情况 术后6个月，15例患者15眼角膜感染均得到控制，无复发情况。感染控制率为100%。

2.2 术后植片透明度及新生血管长入情况 术前及术后不同随访时间点间角膜植片透明度评分的总体比较，差异有统计学意义(χ2=38.43，P<0.01)。裂隙灯显微镜下观察，术后角膜植片随着时间延长逐渐变得透明(图1)。术前除1例植片外，14例植片均为重度混浊。术后1～3个月的随访中，呈重度混浊的植片例数逐渐减少。至术后6个月，已有3例完全透明、5例轻度混浊、6例中度混浊、仅1例呈重度混浊（图2）。术前及术后不同随访时间点间角膜新生血管评分的总体比较，差异有统计学意义(χ2=11.05，P=0.026)。至术后6个月，15例患者中13例新生血管评分与术前相比维持不变或降低，仅2例新生血管长入情况加重（图3）。

图1 1例真菌性角膜炎患者行猪角膜脱细胞基质治疗前后裂隙灯显微镜照片 A.术前可见角膜中央直径约4 mm的瓷白色病灶，可见前房积脓；B.术后1周可见结膜充血，角膜植片混浊水肿；C.术后1个月可见结膜充血减退，角膜植片混浊水肿减轻；D～E.术后2～3个月，角膜植片无水肿，虹膜纹理清；F.术后6个月，角膜植片完全透明。

图2 术前及术后各随访时间点的角膜透明性评分构成情况

图3 术前及术后各随访时间点的角膜新生血管评分构成情况

2.3 视力结果 患者术前、术后1个月、术后2个月、术后3个月和术后6个月行视力检查，平均视力（logMAR）分别为2.08±0.45、1.92±0.50、1.71±0.51、1.52±0.62、1.13±0.46。术后3个月及术后6个月的平均视力与术前相比，差异均有统计学意义(t=2.954，P=0.012；t=8.093，P<0.01)。至术后6个月，15例患者中有13例视力达脱盲标准，脱盲率为86.7 %（图4）。

图4 术前及术后BCVA变化情况 *示P<0.05，**示P<0.01。

2.4 术后前节OCT与共聚焦显微镜检查 术后6个月，前节OCT检查显示患者术后植床和植片层间愈合良好，角膜厚度正常。共聚焦显微镜检查显示，术后6个月已可见植片内有上皮下神经纤维长入；植片浅及深基质层均探及基质细胞（图5）。

图5 术前及术后前节OCT及共聚焦显微镜检查结果 A.术后6个月前节OCT结果显示良好的层间愈合； B和C.术后6个月共聚焦显微镜检查可探及角膜上皮下神经纤维及基质层基质细胞。

2.5 术后相关并发症 在随访中，1例出现角膜上皮愈合延迟，1例出现角膜移植排斥，1例出现术后继发性高眼压，2例出现角膜缝线松脱。1例患者在术后1周内角膜上皮未完全愈合，荧光素钠染色呈阳性，给予角膜接触镜佩戴治疗1个月后上皮愈合良好。1例患者术后1个月出现角膜缝线松脱伴基质型排斥反应，拆除其松脱的缝线并给予频繁糖皮质激素滴眼，3 d后病情好转；后持续给予抗排斥药物治疗，1个月后复查病情稳定。1例患者在术后1个月出现继发性眼压升高，降眼压药物治疗无效，行小梁切除术后指测眼压恢复正常。随访期内无一例发生植片脱落或溶解。

3 讨论

同种异体板层角膜移植手术已广泛应用于感染性角膜炎的治疗。积极的手术可以最大程度地清除感染灶，减少局部抗生素的使用，增加患者的依从性，有效缩短病程，促进视力的恢复[8]。由于同种异体角膜材料的限制，很多患者得不到及时治疗，而延误最佳治疗时机，造成难以挽回的损失。研发适合板层移植的新型替代材料是解决这一问题的关键。本研究中采用的生物工程角膜即猪角膜脱细胞基质，是利用猪眼角膜经过脱细胞、去抗原和灭活病毒等工艺制备而成，保留了天然角膜胶原纤维结构，有利于细胞附着、移行和增生，引导基质胶原合成及上皮再生，可逐渐被机体细胞所改建，具有良好的生物相容性[9]。

在我们观察的系列病例中，术后6个月，15例患者15眼角膜感染均得到控制，感染控制率达100 %。同样利用猪角膜脱细胞基质进行板层手术，郑钦象等[10]报道的20例患者术后6个月的感染控制率为95 %，刘志玲等[11]报道的44例患者术后12个月的感染控制率为91%。以往文献[12-13]报道同种异体角膜深板层移植术后的真菌性角膜炎复发率为7.6 %～20.0 %。因此可看出，用于板层角膜移植的生物工程角膜与同种异体角膜相比，并未加重感染复发风险。有研究[14]发现，晚期复发(术后15～60 d)患者术前常合并前房积脓，真菌菌丝生长旺盛；或与术后药物减量及糖皮质激素加用的时机选择有关。这也可以解释本研究中1例患者复发的可能原因。脱细胞基质材料经过特殊工艺处理，去除了细胞成分、降低了角膜的免疫原性，从而减少了术后发生炎症反应和免疫排斥反应的概率[15-16]。本组15例患者中仅有1例发生了基质型排斥反应，并且在进行了抗排斥药物治疗后排斥反应得到控制。其余14例患者在随访期间均未发生排斥反应且未见植片溶解或脱落。本研究显示了较低排斥及复发发生率，进一步证实了猪脱细胞基质应用于治疗感染性角膜炎的安全性。此外，本研究发现患者术后视力在随访期间逐渐提高，术后3个月及6个月与术前相比，差异均有统计学意义。术后6个月的脱盲率为86.7 %。在郑钦象等[10]的研究中，采用生物工程角膜治疗感染性角膜炎的20例患者，术后1周植片水肿即消失，透明性明显改善，视力显著提高；术后6个月的脱盲率可达100%。而刘志玲等[11]则发现生物工程角膜术后1、3、6个月的植片透明度明显低于同种异体角膜植片，直至术后12个月无显著差异。Zhang等[17]的研究也显示生物工程角膜在术后6个月～3年间逐渐变透明。这与本研究的结果相符合。我们猜测，生物材料板层角膜移植术后早期角膜植片透明度较差，可能是由于冷冻保存及材料使用前复水过程致水肿，随着角膜内皮泵功能恢复排出多余水分以及基质材料在与角膜相容过程中不断发生重构，植片水肿可逐步消退，透明度可逐渐改善，视力将逐步提高。这说明猪脱细胞基质材料应用于感染性角膜炎患者，不仅可控制感染，也可恢复患者受损的视功能，具备有效性。由于本研究观察时间和样本量的限制，对患者视力的远期效果及安全性评价还需要进一步研究。

我们知道，角膜上皮下神经不仅可以维持角膜上皮的健康和完整，还能调节眼表泪膜的分泌[18-19]。本研究通过共聚焦显微镜检查发现术后6个月即可探及基质材料中长入的上皮下神经纤维组织，该结果与前人的研究相似[20-21]。这似乎也解释了术后早期易发生角膜上皮延迟愈合的原因。角膜移植后神经再生和修复是眼表重建的基础，术后早期植片内未长入上皮下神经易引起持续性上皮缺损，需给予关注。与王素娟等[19]的研究结果不同，我们在术后6个月通过共聚焦显微镜发现了猪脱细胞基质材料内出现了基质细胞，对其生长的作用和机制值得进一步研究。此外，本研究中发现2例移植术后角膜缝线松脱。有研究[11]认为，生物工程角膜组由于术后早期复水植片组织的水肿较重，随访过程中植片水肿不断减轻可导致发生缝线松脱的比例高于人供体角膜组。这也提示临床工作者在术后随访过程中应更加关注缝线的松脱情况并及时处理，避免发生缝线相关并发症，增加感染及排斥的风险[22]。

总体而言，猪脱细胞基质材料应用于治疗感染性角膜炎患者是安全、有效的。作为替代材料对患者进行角膜移植可有效缓解同种异体角膜供体的匮乏，其远期临床价值还需进一步研究与探讨。