异常威客汉姆酵母产酯酶培养基优化及发酵液香气物质分析

石 馨,惠 明,田 青,黄继红

(河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001)

酯酶(E.C.3.1.1.1)是催化酯键合成和水解的一类酶的总称[1],广泛存在于动物、植物和微生物中,其中微生物源的酯酶在工业生产中应用最多[2-3]。已有研究证明:酵母[4-5]、霉菌[6]和细菌[7]均可产生酯化酶,在培养过程中可产生丰富的酯类风味物质[8-12],比如己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等,均能呈现出不同的风味,这些酯类对发酵产品的感官指标有较大的影响,并且酯类物质都属于白酒风味的重要贡献物质。因此,酯化酶广泛应用于白酒工业,为白酒提酯增香[13-14],改善普通白酒酯香味不足的质量缺陷[15-19]。异常威客汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)在培养过程中可产酯类、醇类和有机酸类等风味物质,对香气的形成起着重要作用,常常作为白酒酿造、发酵食品的重要功能微生物。笔者以实验室保藏的异常威客汉姆酵母Y-1为出发菌株,通过响应面法对其发酵产酯酶培养基进行优化,确定适宜的培养基组分,用以提高Y-1菌所产酯酶的活力,并采用固相微萃取法(SPME)对其发酵液挥发性成分进行提取,结合气质联用仪(GC-MS)对其进行定量分析,研究Y-1菌的产酯风味成分,为其推广应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌 种

异常威客汉姆酵母Y-1,本实验室分离及保藏。

1.1.2 主要试剂

乙腈、对硝基苯酚乙酸酯,上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 培 养 基

YPD培养基、PDA培养基,购自瑞楚生物公司。

液体产酯发酵培养基(质量浓度):葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,蛋白胨20 g/L,(NH4)2SO40.2 g/L,KH2PO40.2 g/L,MgSO40.2 g/L,CaCl20.2 g/L。

1.2 仪器与设备

电子分析天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;UV-2450紫外可见分光光度计、QP2010气质联用仪,日本岛津有限公司;固相微萃取装置(SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头),江苏默克仪器有限公司;ZHJH-C1112C超净工作台、ZQZY-CS全温恒温培养摇床、ZXSD-A1160恒温培养箱,上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化及发酵培养

将菌株接入YPD液体培养基中,培养条件为温度28 ℃,转速120 r/min条件下培养24 h,再将菌液稀释涂布于YPD固体培养基,28 ℃培养24 h,相同培养条件下活化2次,将活化后的菌体接至斜面PDA培养基,于4 ℃冰箱保藏。产酯发酵时,将种子液按体积分数8%的接种量接至液体发酵培养基,培养条件与菌种活化时一致。

1.3.2 生长曲线的测定

挑取两环活化好的菌体,接入YPD液体培养基中,以温度28 ℃、摇床转速120 r/min条件下培养22 h,每2 h测1次600 nm处的吸光度OD,以培养时间为横坐标,OD600为纵坐标,绘制菌株生长曲线。

1.3.3 酯酶活力测定

酯酶活力测定方法参考文献[20]的方法。

1.3.4 单因素实验

分别以玉米淀粉、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖作为碳源,质量浓度均为10 g/L,同时保证培养基其余组分不变。装液量为100 mL∶250 mL,接种量按体积分数8%接种,温度28 ℃,转速120 r/min条件下培养24 h,测定酯酶活力。

分别以酵母浸粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、NH4NO3和KNO3作为氮源,质量浓度均为20 g/L,同时保证培养基其余组分不变。装液量为100 mL∶250 mL,接种量按体积分数8%接种,温度28 ℃,转速120 r/min条件下培养24 h,测定酯酶活力。

1.3.5 Box-Behnken实验设计

利用Design-Expert 8.0软件创建Box-Behnken实验设计。通过单因素实验可知:影响较大的3个因素为酵母膏、NH4Cl和玉米淀粉,以酯酶活力作为响应值,记为变量Y。根据初始培养基的产酯酶结果,设计了3因素3水平的响应面实验设计,因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnke实验设计因素水平

1.3.6 香气物质分析

按照1.3.1的方法进行发酵培养,培养结束后8 000 r/min离心5 min,取上清液,即为发酵液。精确量取8 mL发酵液,缓慢加入到20 mL的顶空瓶中,倒入时样品不得沾到瓶壁,以免萃取头沾到样品,对结果产生影响。加入1 μL的内标物(2%乙酸正丁酯),再倒入1 g的NaCl,立刻将样品瓶密封压紧。NaCl的加入能够促进香气成分挥发,在同样的处理条件下,加入NaCl的样品可检出物质种类明显增加,并且检出同一物质的质量分数增大,能够最大程度地全部检出;萃取温度选择45 ℃,温度过低,会导致检测出的物质质量分数偏低,温度过高,可增强物质的挥发能力,同时解吸能力也增大,也会使检测物质质量分数变小。萃取之前,先将顶空瓶置于45 ℃水浴中平衡10 min,平衡结束之后萃取50 min。详细萃取方法以及气相色谱、质谱条件参考文献[21]的方法。

2 结果与分析

2.1 生长曲线绘制

所测得的异常威客汉姆酵母菌生长曲线如图1所示。由图1可知:在0～2 h,菌液浓度缓慢上升,属于新环境的适应阶段,为迟滞期;在2～8 h,菌液浓度加速升高,为快速生长期,此时期以最快的速度进行繁殖;8 h后随着时间的增长,吸光度值呈现缓慢上升的趋势,这时培养体系中缺乏了菌体生长所需的养分,菌体逐渐减小直至死亡,故在8～20 h的前段为稳定期,后段为衰退期。因此,在相同培养条件下制备种子液,培养至10 h左右即可满足实验要求。

图1 异常威客汉姆酵母Y-1生长曲线Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae Y-1

2.2 单因素实验

碳源通过微生物代谢作用为微生物整个生长过程提供能量[22],碳源的不同种类对微生物酶的产生具有直接影响;同时,微生物因其可以将碳源转化成自身的细胞组成成分,所以微生物的生长对碳源也具有选择性,即二者之间存在双向选择的关系[23]。在实验中,共探究了4种不同碳源对产酯酶的影响,其结果如图2所示,当酯酶活力最高时,碳源为玉米淀粉,以葡萄糖作为碳源时酯酶活力相对较低,说明碳源的种类对菌株产酯酶活力具有一定影响,因此选取玉米淀粉为固定碳源。实验以玉米淀粉为固定碳源,考察不同有机氮源和无机碳源对产酯酶活力的影响微生物细胞中的含氮物质通常利用氮源物质来合成,仅有少数情况下也会被作为能源物质,微生物对碳源的利用同样具有选择性。结果表明:有机氮源对发酵产酯酶活力的影响程度与碳源的影响程度相差不大,但是无机氮源对产酯酶活力的影响较大,实验以氯离子最为明显,与杨晓曦等[24]所研究的含有氯离子的无机氮源可以促进产酶的结果一致。

图2 不同碳源、氮源对产酯酶活力的影响Fig.2 Effects of carbon source on producing esterase activities

2.3 Box-Behnke设计与分析

用Design-Expert 8.0软件中的Box-Behnken设计方法,选取了3个对酯酶活性有明显影响的因素,在3个水平下对酯酶活力的影响作进一步研究和探讨,以获得其最佳发酵培养基,共17个实验点,实验设计及结果如表2所示。

表2 Box-Behnke实验设计因素水平及响应值

利用Design-Expert 8.0软件,以异常威客汉姆酵母Y-1菌株所产酯酶活力(U/mL)为响应值,A(酵母膏质量分数)、B(NH4Cl质量分数)、C(玉米淀粉质量分数)为自变量,拟合得到回归方程为

Y=0.25+0.022A-3.694B+0.063C-

6.694AB-0.020AC+5.387BC+

2.258A2-0.062B2-0.037C2

对回归模型进行显著性分析,得到显著性检验结果如表3所示。由表3可以看出:本实验所选的模型回归方程P<0.01,F=12.41。回归方程的显著性一般通过F值来反映,对应P值越小,说明相应变量的显著性就越高,所以此回归模型显著;模型中的一次项A,C和二次项B2对响应值的影响达到极显著水平(P<0.01),二次项C2达到显著水平(P<0.05)。失拟项(Lack of fit)代表模拟函数与真实函数之间的差异,差异越小意味着效果越好,一般通过P值的显著性来判断,P值越大,说明拟合的模型方程效果越好。表3显示:本实验模型的失拟项P=0.300 4,其P>0.05,不显著,说明该方程对实验拟合较好,与真实实验不存在分歧,该模型可用于本实验条件下的培养基组分优化。根据软件计算结果,可得各因素对应的实验值分别为A=1,B=0.02,C=0.29,此时响应值Y为最大值,Ymax=0.275 U/mL。由回归方程方差结果可知:决定系数为0.941,调整决定系数为0.865 2,说明模型解释了响应变量中大约14%的变异,说明该方程对实验结果拟合度较高,可以应用于实际实验中的分析。

表3 回归方程显著性分析

2.4 响应面优化及验证实验

利用Design-Expert 8.0软件得到多元二次回归方程所代表的响应曲面及等高线图如图3～5所示,通过图形可以直观反映出3个因素之间相互作用的影响程度。响应面中的曲线弯曲程度不同则代表因素对结果的影响不同,越弯曲则说明研究因素对结果影响越大;等高线越趋近于椭圆,则说明研究因素的交互作用对于响应值作用显著,呈圆形则说明交互作用不显著,颜色过渡变化的越快表明坡度越大,对结果影响越显著[25]。经软件分析,单个因素对酯酶活力的影响比交互项的影响显著。由图3可知:随NH4Cl质量的增加,酯酶活力逐渐降低,随酵母膏的增多,酯酶活力逐渐增高。由图4可知:玉米淀粉和酵母膏对酯酶活力的影响均随每个因素增大,增加到最大值后再逐渐减小。由图5可知:随玉米淀粉的量增加,酯酶活力有所提高,随NH4Cl增加,酯酶活力先提高后再下降。

图3 酵母膏和NH4Cl质量分数对酶活力的交互影响Fig.3 The interactive influence of yeast extract and NH4Cl mass fraction on enzyme activity

图4 酵母膏和玉米淀粉质量分数对酶活力的交互影响Fig.4 The interactive influence of the content of yeast extract and corn starch on enzyme activity

图5 NH4Cl和玉米淀粉质量分数对酶活力的交互作用影响Fig.5 The interactive Effect of NH4Cl and corn starch content on enzyme activity

为了验证该模型预测的准确性和适用性,按照优化后的培养基(质量浓度):酵母膏10 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,玉米淀粉2.9 g/L,蛋白胨20 g/L,(NH4)2SO40.1 g/L,KH2PO40.1 g/L,MgSO40.1 g/L,CaCl20.1 g/L,在此条件下进行实验,所得结果为0.263 U/mL,验证值与模型预测值0.275接近,说明该模型可以较好地预测实验结果,运用响应面实验优化异常威客汉姆酵母Y-1产酯酶的发酵培养基是可行的,并有较好的适用性。

2.5 香气物质的分析

2.5.1 发酵液中挥发性组分总体分析

发酵液挥发性组分固相微萃取后,经GC-MS分析,总离子流色谱图如图6所示,与质谱数据库比对,并结合保留时间对待测样品中挥发性物质进行定性,共鉴定出41种挥发性物质。发酵液中挥发性物质种类包括酯类、酸类、烷类和其他类(酚类、酮类和苯等),但不同类型挥发性物质的数量区别较大。发酵液中所含酯类、烷类较多,分别有17,7种,其相对质量分数分别为86.23%,2.44%;酸类种类较少,有5种,其相对质量分数为2.47%;其他物质种类共有12种,相对质量分数为8.86%。

图6 挥发性成分GC-MS总离子流图Fig.6 Total ion chromatography of GC-MS of the volatile components

2.5.2 发酵液中酯类物质鉴定结果分析

白酒酿造过程中的酯类物质是由酸和醇酯化作用形成,主要形成途径有白酒发酵过程中相关微生物的代谢反应生成;白酒发酵过程中添加的大曲及糖化剂催化形成相应酯类物质;通过单纯的有机反应合成酯[28]。这些脂类大多数会呈现花香及果香,是白酒中的主要呈香物质[29]。经分析得到发酵液中的主要酯类(0.1%以上),物质种类及相对质量分数如表4所示。其中己酸乙酯质量分数最高(除内标液乙酸正丁酯),占10.345%,可能为该菌株的特征性酯类物质,其次质量分数较高的分别是乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯和戊酸乙酯,相对质量分数分别为1.719%,1.216%,0.343%,不同的酯类物质有着不同的香气,构成了白酒的不同风味特征。比如己酸乙酯,具有强烈的果香;辛酸乙酯,有一定的白兰地酒香;庚酸乙酯,有菠萝香气。

表4 主要酯类成分相对质量分数表

3 结 论

通过单因素试验确定了适宜异常威客汉姆酵母Y-1生长的最适碳源、氮源,然后设计响应面优化实验对培养基组分进行优化,最终得到了菌株Y-1的培养基组分,确定了各组分的最佳添加量,并在此组分下验证实验,酯酶活力达到0.263 U/mL,是优化前的4.3倍,且与预测值0.275接近,说明该模型具有较好的适用性;利用固相微萃取以及气质联用仪对该培养组分下菌株Y-1发酵液挥发性成分进行提取并分析,共检测出17种酯类物质,其相对质量分数占总挥发成分的86.23%。通过微生物产酯化酶来改善白酒品质是提升我国白酒质量的一个研究方向,同时也为酯酶的开发和应用提供了理论参考。