添加微量元素螯合剂的L-色氨酸发酵研究

刘小都

(河南巨龙生物工程股份有限公司,河南 汝州 467599)

色氨酸是一种含有吲哚基的中性芳香族氨基酸,有L型和D型二种异构体,其中L-色氨酸作为人体8种必需氨基酸之一被广泛研究,其在人体代谢活动中除了参与蛋白质合成外,还具有调节神经系统活动、促进睡眠、提高免疫力和维持脑组织功能正常等功能,因此被广泛应用于医药、食品和饲料等行业[1-2]。L-色氨酸也被认为是人体及动物所需8种必须氨基酸中的第二必需氨基酸[3]。在医药、食品和饲料等行业供不应求,因此探索如何提高色氨酸产量具有重大意义[4-6]。

色氨酸生产方法有传统的化学合成法、蛋白质水解法以及后续发展起来的酶法、微生物转化法和微生物直接发酵法[7-11]。传统的生产方法存在环境污染严重、设备要求高和生产成本高等缺点[12],逐渐被原料简单、反应条件温和及生产成本低的微生物法所取代,因此微生物直接发酵成为了目前L-色氨酸大规模工业化生产的常用方法[13]。然而,微生物直接发酵法生产L-色氨酸也面临着许多亟待解决的问题,例如,微量元素是微生物正常生长代谢不可或缺的营养成分,在微生物的生长和生产活动中发挥着极其重要的作用,其与酶的活动密切相关,或者是可以作为酶的活性基团的成分,或者是作为酶的激活剂,但是发酵生产中常用的微量元素添加剂为无机盐类,包括硫酸锰、硫酸铁和硫酸锌等,这类微量元素添加剂存在着混合不均匀、易潮解、易氧化和吸收利用率低等缺点,这就造成了菌体在生长及生产过程中菌体活力下降,产酸能力不足等问题[14-17]。而以氨基酸锌、氨基酸铁、氨基酸锰和氨基酸铜为代表的氨基酸微量元素螯合剂具有化学稳定性好、易吸收、生物学效价好、抗干扰能力强和刺激小等优点,可以起到补充微量元素营养并且兼有氨基酸强化剂的作用,能够有效提高发酵菌体的生长和生产性能[18-25]。以EscherichiacoliTRTH为供试菌株,对供试菌株的初始发酵培养基中氨基酸螯合剂的添加进行研究,通过单因素实验和正交实验探究氨基酸螯合剂的最适添加量,为解决菌株发酵生产色氨酸时在发酵过程中由于微量元素吸收利用率低所带来的一系列问题提出建设性意见,从而提高菌体的产酸能力,进一步提高色氨酸产量。

1 材料与方法

1.1 菌 种

EscherichiacoliTRTH(trpEDCBA+TetR,Δtna)和(Phe-+Tyr-+5-MTR+5-FTR+CINR+SGR),公司菌种保藏中心提供。

1.2 培 养 基

活化斜面培养基(质量浓度):蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,牛肉膏10 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,琼脂粉20 g/L,四环素50 mg/L。

种子培养基(质量浓度):葡萄糖30 g/L,酵母粉4 g/L,柠檬酸0.5 g/L,(NH4)2SO41 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,VB11 mg/L,VH0.3 mg/L。

发酵培养基(质量浓度):葡萄糖10 g/L,酵母粉4 g/L,柠檬酸2 g/L,(NH4)2SO44 g/L,KH2PO46 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,VB15 mg/L,VH0.2 mg/L。

1.3 主要仪器

LDZH-100KBS型全自动立式蒸汽灭菌器,天津博鑫生物科技有限公司;5 L和30 L自动控制发酵罐,上海保兴生物设备工程有限公司;SBA-40E生物传感分析仪,山东省科学院生物研究所;KQ-C高压蒸汽发生器,上海奉贤协新机电厂;752分光光度计,上海分析仪器厂;OLYMPUS生物显微镜,日本OLYMPUS会社。

1.4 培养方法

1.4.1 菌种活化

取甘油管中菌种接种于活化斜面培养基中,37 ℃恒温传代活化2次,每次培养24 h。

1.4.2 种子培养

5 L发酵罐,初始发酵液体积定容至3 L。初始通气量为2 L/min,初始搅拌转速为200 r/min,通过自动流加25%的氨水控制发酵液pH在7.0～7.2,通过搅拌和通风控制溶氧,以消泡剂消泡,恒温37 ℃培养,溶氧维持在25%～30%。

1.4.3 发酵培养

30 L发酵罐,初始发酵液体积定容至12 L。恒温37 ℃培养,通过自动流加25%的氨水控制培养基pH在7.0～7.2,控制溶氧在25%～40%,发酵过程中以泡敌消泡;底物葡萄糖消耗完后,根据DO反馈补料策略,流加质量浓度为800 g/L的葡萄糖溶液,维持零残糖发酵;过程中每隔2 h测样、记录数据。

1.5 检测方法

1.5.1 发酵液pH的测定

采用发酵罐自带的梅特勒pH电极进行测定,pH在6.4～7.0,精密pH试纸辅助测定。

1.5.2 发酵液中残糖测定

每隔2 h进行取样,离心,取上清,将上清稀释100倍,用SBA-40E生物传感分析仪检测发酵液中残糖质量分数。

1.5.3 菌体生物量的测定

菌体密度以菌体干质量表示,取10 mL发酵液,13 000 r/min离心管内离心2 min,将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中80 ℃干燥至恒质量后用分析天平称量。菌体生物量计算式为

式中:m1为离心管的质量;m2为含菌体离心管干燥后的总质量;V为测定用发酵液体积。

1.5.4 发酵液中L-色氨酸质量浓度的测定

采用对二甲氨基苯甲醛比色法和高效液相色谱法对不同样品中的L-色氨酸质量浓度进行检测,具体操作条件和步骤参考文献[11]。

1.5.5 糖酸转化率计算

糖酸转化率SA计算公式

式中:SA为糖酸转化率;ρ为L-色氨酸质量浓度;V为发酵液总体积;m为总耗糖质量。

所有实验数据取3次实验的平均值。单因素方差分析之后,Dunnet t检验来确定数据差异的显著性(P<0.05)[14]。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 蛋氨酸螯合铁对色氨酸发酵的影响

为考察蛋氨酸螯和铁对色氨酸发酵的影响,在1.2发酵培养基中添加5组不同质量浓度的蛋氨酸螯合铁(在不添加其他氨基酸和微量元素螯合剂的条件下),分析不同质量浓度的蛋氨酸螯合铁对色氨酸发酵中生物量、色氨酸产量和糖酸转化率指标的影响,结果如图1所示。

图1 不同质量浓度的蛋氨酸螯合铁对生物量、 L-色氨酸产量和糖酸转化率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of iron methionine chelate on biomass, L-tryptophan yield and sugar acid conversion rate

由图1可以看出:随着蛋氨酸螯合铁的质量浓度的增加,色氨酸发酵过程中生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率逐渐上升,但当蛋氨酸螯合铁质量浓度超过了320 mg/L时,生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率出现下降。通过分析,铁元素是微生物正常生命活动所必须的营养成分,而蛋氨酸螯合铁加快了菌体对于铁元素的吸收,增加了菌体的活力,导致菌体量有较大幅度的提升,同时伴随着菌体活力的上升,菌体的发酵性能也出现了上升。但是菌体对于铁元素的耐受能力是有一定限度的,过量的微量元素会起到毒害作用,所以菌体在蛋氨螯合酸铁超过一定量后,生物量和L-色氨酸产量出现明显下降。选择合适的蛋氨酸螯合铁质量浓度才能起到提高菌体活力的效果,因此蛋氨酸螯合铁的最适质量浓度选择为320 mg/L,此时最大生物量为49.8 g/L,L-色氨酸产量为50 g/L,糖酸转化率为18.9%。

2.1.2 蛋氨酸螯合锰对色氨酸发酵的影响

将5组不同质量浓度的蛋氨酸螯和锰(在不添加其他氨基酸微量元素螯合剂的条件下)添加到1.2发酵培养基中,考察蛋氨酸螯和锰对色氨酸发酵的影响,分析不同质量浓度的蛋氨酸螯合锰对色氨酸发酵中生物量、色氨酸产量和糖酸转化率指标的影响,结果如图2所示。

图2 不同质量浓度的蛋氨酸螯合锰对生物量、 L-色氨酸产量和糖酸转化率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of manganese methionine chelate on biomass, L-tryptophan yield and sugar acid conversion rate

由图2可以看出:当蛋氨酸螯合锰的质量浓度达到240 mg/L时,菌体生长及产酸性能最好,最大生物量为50.3 g/L,L-色氨酸产量为52 g/L,糖酸转化率为19.2%。当蛋氨酸螯合锰的质量浓度不超过240 mg/L时,生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率逐渐上升;当蛋氨酸螯合锰的质量浓度超过240 mg/L时,生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率出现明显下降。锰元素是菌体中磷酸烯醇式脱羧酶、柠檬酸合成酶和磷酸转移酶等酶的重要组成成分,蛋氨酸螯合锰过少时不足以提供菌体代谢所需的锰元素,过高时锰元素的毒害作用又会抑制菌体生长和生产活动,选择合适的蛋氨酸螯合锰质量浓度才能起到提高菌体活力和发酵性能的作用,所以蛋氨酸螯合锰最适质量浓度选择为240 mg/L。

2.1.3 丙氨酸螯合锌对色氨酸发酵的影响

为考察丙氨酸螯和锌对色氨酸发酵的影响,在1.2发酵培养基中添加5组不同质量浓度的丙氨酸螯和锌(在不添加其他氨基酸微量元素螯合剂的条件下),分析不同质量浓度的丙氨酸螯合锌对色氨酸发酵中生物量、色氨酸产量和糖酸转化率指标的影响,结果如图3所示。

由图3可以看出:生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率随着丙氨酸螯合锌的质量浓度的上升出现先增长后下降的趋势,出现这种现象的原因主要是丙氨酸螯合锌的添加填补了微生物对于锌元素的需求,增加了微生物菌体内多种脱氢酶、磷酸酯酶、醛缩酶和羧肽酶等酶的活力,从而提高了菌体的活力,增加了L-色氨酸的产量;当丙氨酸螯合锌添加过量时,菌体会吸收过量的锌,锌作为一种重金属元素,质量浓度过高会抑制菌体生长,进而影响菌体的发酵性能。为了达到最大程度增加菌体活力和菌体发酵产酸能力的目的,最终选取80 mg/L的丙氨酸螯合锌作为最适质量浓度,此时最大菌体量为48.2 g/L,L-色氨酸产量为49 g/L,糖酸转化率为19.3%。

2.2 正交实验设计优化

在单因素实验的基础上确定实验因素,蛋氨酸螯合铁、蛋氨酸螯合锰和丙氨酸螯合锌的最佳质量浓度分别为320,240,80 mg/L。继续以生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率为考察因素,选用L9(33)为正交实验表设计3因素3水平正交实验,对色氨酸发酵的关键因素进行分析,正交实验因素水平如表1所示,其实验结果和单因素实验结果基本一致,说明氨基酸微量元素螯合剂的添加对L-色氨酸的发酵有益,实验数据如表2所示,极差R分析如表3所示。

表1 色发酵正交实验因素水平表

表2 色氨酸发酵正交实验设计及结果

表3 正交实验极差分析表

为进一步确定不同因素的最优化组合,以不同因素水平为横坐标,以不同考察指标为纵坐标[26],制得不同因素水平对生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率的趋势图如图4所示[27]。

图4 不同实验因子与响应指标关系趋势图Fig.4 Trend chart of relation between different test factors and response indexes

由图4可以看出:对于不同的考察指标因素A2和B2都为最优水平,且B因素对不同考察指标的变化趋势最大,这与表2,3中分析B对考察结果的影响最大结果一致;随着C因素的变化,生物量虽然有小幅上涨,但是糖酸转化率和L-色氨酸产量却逐渐降低,糖酸转化率和L-色氨酸产量的变化幅度明显大于生物量的变化幅度,同时在发酵行业中目标产品的糖酸转化率和产量是主要的技术及经济指标,应根据主要指标进行优选B2C1组合,综合考虑以上结果,优选既提高菌体生物量又能增加L-色氨酸产量和糖酸转化率的组合,因此最佳氨基酸微量元素螯合剂添加条件为A2B2C1,即蛋氨酸螯合铁质量浓度320 mg/L、蛋氨酸螯合锰质量浓度240 mg/L、丙氨酸螯合锌质量浓度40 mg/L。

2.3 验证实验结果

因实验中添加的氨基酸微量元素螯合剂中同时能为微生物提供氨基酸和相应微量元素,为排除添加氨基酸微量元素螯合剂实验时带入发酵培养基中氨基酸基团对实验的影响,同时依据正交实验所得的氨基酸微量元素螯合剂最佳添加组合,进行多批次不同策略方式进行平行发酵验证保证实验的严谨性和科学性,所得实验结果如图5,6和表4所示(方式1表示不添加等浓度氨基酸和相应微量元素;方式2表示添加等浓度氨基酸和相应微量元素;方式3表示添加氨基酸微量元素螯合剂)。由图5可以看出:通过对比3种不同发酵策略的生物量发酵过程曲线,方式1和方式2的最大菌体量分别为44.4 g/L和47.5 g/L,发酵后期菌体量分别为39.8,45.0 g/L,下降幅度分别为4.6,2.5 g/L;方式3,即添加氨基酸微量元素螯合剂的最大菌体量为50.3 g/L,发酵后期菌体量为49.0 g/L,最大菌体量下降幅度仅为1.3 g/L,较方式1和方式2的最大菌体量分别提升了13.3%,5.9%,下降幅度分别降低了71.7%,48.0%。表明氨基酸微量元素螯合剂对于促进菌体的生长代谢具有明显作用。

图5 不同添加方式对于生物量的影响Fig.5 Effects of different addition methods on biomass

表4 3种发酵方式对于糖酸转化率的影响

由图6和表4可以看出:方式1和方式2的L-色氨酸最终产量分别为47.7,51.0 g/L,糖酸转化率分别为17.9%,19.1%;方式3,即添加氨基酸微量元素螯合剂的L-色氨酸最终产量为54.2 g/L,糖酸转化率为20.8%,较方式1和方式2的L-色氨酸的最终产量分别提高了13.6%,6.9%,糖酸转化率分别提高了16.2%,6.7%。

图6 不同添加方式对于L-色氨酸产量的影响Fig.6 Influence of different addition methods on L-tryptophan yield

综上结果,出现这种现象主要是因为微量元素是微生物生长所必需的物质,适当添加微量元素能够有利于菌体内各种酶的合成,提高酶的活力从而提高菌体自身的活力,加快菌体生长,所以方式2和方式3对于菌体生长和发酵产酸有明显益处。同时,相较于无机盐类的微量元素添加方式,采用氨基酸微量元素螯合剂效果更加明显:一方面,氨基酸微量元素螯合剂的吸收效率高,比无机微量元素高30%,氨基酸微量元素螯合剂是利用配位体(氨基酸或肽)的转运系统吸收,而不是金属元素的转运系统,故不必先同其他物质结合[17];另一方面,金属微量元素能以配位键或离子键与氨基酸配位体键合,使自身被保护在络合物的中心,通过配位体的转运系统,以络合物的形式穿过黏膜进入细胞内,从而减弱金属微量元素之间的拮抗作用,大大提高金属微量元素的利用率[20,23]。

3 结 论

通过单因素实验和正交实验,在初始装液量为12 L的30 L发酵罐的常规发酵配方中添加蛋氨酸螯合铁质量浓度320 mg/L,蛋氨酸螯合锰质量浓度240 mg/L,丙氨酸螯合锌质量浓度40 mg/L时,最大菌体量为50.3 g/L,发酵后期菌体量为49.0 g/L;L-色氨酸最终产量为54.2 g/L,糖酸转化率为20.8%;较常规发酵的最大菌体量提升了13.3%,下降幅度降低了71.7%,提高了发酵后期的菌体活力;L-色氨酸最终产量提高了13.6%,糖酸转化率提高了16.2%。这主要是因为氨基酸微量元素螯合剂的添加,保证了各种微量元素的高效利用,提高了菌体的活力,促进了菌体的产酸能力,所以本研究为进一步提高色氨酸发酵产量提供了新的研究思路。