加味六安煎对咳嗽变异性哮喘模型豚鼠白细胞介素-4、白细胞介素-13水平及气道重塑相关基因表达的影响

张宁宁 吴力群 陈海鹏 霍婧伟 徐方蔚 廖欣婷 李盼盼 路晨 陈宇航

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一种以咳嗽为主要或唯一临床表现的特殊类型的哮喘，是中国儿童慢性咳嗽的主要原因[1]。本病儿童虽无明显喘息、气促等表现，常因遇冷空气或者运动后加剧，反复发作，若不及时治疗易发展为哮喘，严重影响患儿的学习生活和身心健康。加味六安煎是临床治疗儿童咳嗽的有效方剂[2]，课题组前期通过大鼠实验研究发现，本方可通过调整CVA大鼠模型体内的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)及白细胞介素(interleukin，IL)-5水平从而减轻炎性细胞浸润及水肿程度，减轻咳嗽次数[3]。同时通过调整基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1, TIMP-1) MMP-9/TIMP-1的平衡从而有效减轻气道重塑[4]。本实验拟通过加味六安煎对CVA豚鼠模型血清及支气管肺泡灌洗液(brocho-alveolar larage fluid, BALF)中IL-4、IL-13水平及气道重塑相关基因转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β) mRNA、MMP-9 mRNA表达的影响，进一步探讨其治疗CVA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康4周龄纯系雄性豚鼠30只，清洁级，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号：SCXK(京2016-0011)。

1.2 实验药品

加味六安煎药物组成：法半夏6 g、橘红6 g、茯苓6 g、杏仁6 g、白芥子6 g、甘草3 g、海浮石20 g、葶苈子6 g、瓜蒌10 g、胆南星4 g、炒莱菔子10 g，低、中、高剂量组分别配制成浓度为0.74 g/mL、1.48 g/mL、2.22 g/mL的溶液。药物由北京中医药大学东方医院制剂室制备；孟鲁司特钠(杭州默沙东制药有限公司产品，规格：4 mg/片)，用生理盐水制成混悬液，于4℃冰箱保存。药品由北京中医药大学东方医院中药房及康仁堂药业提供；卵蛋白(ovalbumin,OVA)(批号: 421C033, Solarbio公司)；氢氧化铝(批号: 20131125，国药集团化学试剂有限公司)；辣椒素(纯度>95%，批号: P12D9S77366, 源叶生物有限公司)。

1.3 造模与分组

将30只健康豚鼠采用随机数字表法分为6组，每组5只。正常对照组、CVA模型组、孟鲁司特钠组、加味六安煎低剂量组、加味六安煎中剂量组、加味六安煎高剂量组。采用OVA和氢氧化铝激发致敏并用OVA激发的方法复制CVA模型豚鼠。正常饲养3天后开始实验，除正常对照组外，其余各组均在第1、8天每只豚鼠腹腔注射10%OVA和氢氧化铝混合溶液1 mL致敏。从第15天起，模型组及各给药组豚鼠置于密闭有机玻璃罩内，给予含1%OVA 溶液的生理盐水超声雾化激发2分钟，每天一次，共10天。激发时观察豚鼠反应， 如出现咳嗽、竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕、腹肌抽动、极度烦躁等现象中两种或两种以上者，或抽搐、虚脱现象之一者，判定为造模成功。

1.4 给药方法与剂量

各组给药剂量按人与豚鼠体表面积换算公式计算。激发之日起，即从实验的第15天开始，用雾化器激发前30分钟，各组分别灌胃给药干预，共治疗10天。正常对照组：不作处理。CVA模型组：灌服生理盐水1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。孟鲁司特钠组：灌服孟鲁司特钠混悬液1.2 mg/kg，每日1次。加味六安煎低剂量组：灌服低浓度加味六安煎溶液，1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。加味六安煎中剂量组：灌服中浓度加味六安煎溶液，1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。加味六安煎高剂量组：灌服高浓度加味六安煎溶液，1.7 mL·100 g-1·d-1，每日1次。加味六安煎低、中、高剂量组分别配制成浓度为低浓度(0.74 g/mL)、中浓度(1.48 g/mL)、高浓度(2.22 g/mL)的溶液，分别相当于体重70 kg成人用量的5倍、10倍、15倍。连续灌胃10天。第26天，取左侧肺上叶组织做病理和免疫组化检测。

1.5 一般状态观察

观察各组豚鼠的饮食、饮水、睡眠、毛发及活动等，测量豚鼠的体质量、饮食等，观察豚鼠的死亡只数及死亡时间。在造模药物干预的过程中，模型组一只豚鼠在雾化过程中发生喘息及痉挛一次，予硫酸沙丁胺醇吸入气雾剂干预后好转。各组豚鼠的饮食及饮水状况良好，毛发颜色光亮，正常对照组精神状态最佳。模型组及各治疗组因均予药物致敏及雾化吸入干预，雾化过程中可闻及不同程度的咳嗽，其中以模型组咳嗽次数最多且咳声响亮。各组豚鼠体质量较均匀。

1.6 标本采集

豚鼠予10 mg/kg水合氯醛腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血，将豚鼠处死，夹板固定后打开胸腔，行气管插管术后结扎右肺，使用PBS溶液分3次行支气管肺泡灌洗，每次2 mL PBS溶液，并回收BALF，随即快速结扎左侧肺门，取左侧肺上叶组织立刻置于冻存管内，迅速移入-80℃液氮冻存。

1.7 ELISA法检测血清及BALF中IL-4及IL-13水平

股动脉取血5 mL，以3000 r/分钟，离心10分钟，分离血清；以3000 r/分钟,离心后留取上清液置-20℃冻存。按照相关试剂盒提供方法操作。

1.8 Real time-PCR法检测肺组织及BALF中TGF-β mRNA及MMP-9 mRNA的表达。

将样本分别用液氮研磨粉碎，加入1 mL Trizol(invitrogen)，吸取到1.5 mL EP管中，加入500 μL酚氯仿，振荡混匀，静止5分钟，置于离心机中于4℃离心十分钟，小心吸取上层上清于一新的离心管中，加入700 μL异丙醇，混匀，于4℃12000 rpm离心10分钟，小心去上清，用75%乙醇洗涤一次，晾干，溶于50 μL DEPC处理水中，电泳检测提取总RNA。使用核酸浓度测定仪测定RNA浓度和纯度。反转录使用invitrogen的反转录试剂盒superscript III。Real time PCR反应体系建立后，将其混匀，瞬离，置于荧光定量PCR仪上，进行反应及循环扩增。扩增反应结束后建立PCR产物的溶解曲线，每个样本分别用待检测基因和内参基因引物扩增，每个反应重复3次。引物信息：actin：上游引物5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’,下游引物 5’-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3’；TGF-β：上游引物5’-GTCCTTGCCCTCTACAACCAAC-3’,下游引物5’-CTGCTCCACCTTGGGCTTG-3’；MMP-9：上游引物5’-GTAACCCTGGTCACCGGACT-3’,下游引物5’-GTAACCCTGGTCACCGGACT-3’。数据采用2-△△CT法计算。

1.9 胶原面积及胶原沉积率检测

处死豚鼠后取出肺组织放入10%甲醛中固定，石蜡包埋，切片，Masson染色。

肺组织常规Masson染色后，采用Image J图像处理软件分子各组肺组织胶原纤维表达，并计算胶原面积、组织总面积及胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)，CVF=胶原面积/组织总面积×100%。

1.10统计学方法

2 结果

2.1 加味六安煎对CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-4水平的影响

血清：与正常对照组相比，模型组IL-4水平降低(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组IL-4呈升高趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)，加味六安煎各剂量组IL-4水平升高(P<0.05)；各治疗组间无显著性差异(P>0.05)。见表1。

BALF：与正常对照组相比，模型组IL-4水平降低(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组IL-4呈升高趋势，加味六安煎各剂量组呈降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)；各治疗组间无明显统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2 加味六安煎对CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-13水平的影响

血清：与正常对照组相比，模型组IL-13水平升高(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组呈降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)，加味六安煎各治疗组IL-13水平均降低(P<0.05)；与孟鲁司特钠组相比，加味六安煎各剂量组IL-13水平降低(P<0.05)；加味六安煎各剂量组间无明显统计学差异(P>0.05)。见表1。

BALF：与正常对照组相比，模型组IL-13水平升高(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组IL-13呈降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)，加味六安煎各治疗组IL-13水平均降低(P<0.05)；与孟鲁司特钠组相比，加味六安煎各剂量组IL-13水平降低(P<0.05)；加味六安煎各剂量组间无明显统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组CVA模型豚鼠血清及BALF中IL-4、IL-13水平比较

2.3 加味六安煎对CVA模型豚鼠肺组织及BALF中TGF-β及MMP-9 mRNA表达的影响

2.3.1 TGF-β mRNA的表达 肺组织：与正常对照组相比，模型组中的TGF-β mRNA表达水平升高(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组呈降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)，加味六安煎各治疗组TGF-β mRNA表达水平均降低(P<0.05)；与孟鲁司特钠组相比，加味六安煎各剂量组TGF-β mRNA表达水平降低(P<0.05)；加味六安煎各剂量组间无明显统计学差异(P>0.05)。BALF：与正常对照组相比，模型组中的TGF-β mRNA表达水平升高(P<0.05)；与模型组相比，各治疗组TGF-β mRNA表达水平均减低(P<0.05)，各治疗组间无明显统计学差异(P>0.05)。见表2。

2.3.2 MMP-9 mRNA的表达 肺组织：与正常对照组相比，模型组中的MMP-9 mRNA表达水平升高(P<0.05)；各治疗组MMP-9 mRNA表达水平均减低(P<0.05)，各治疗组间无明显统计学差异(P>0.05)。BALF：与正常对照组相比，模型组中的MMP-9 mRNA表达水平升高(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组呈降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)，加味六安煎各治疗组MMP-9 mRNA表达水平均降低(P<0.05)；与孟鲁司特钠组相比，加味六安煎各剂量组MMP-9 mRNA表达水平降低(P<0.05)；加味六安煎各剂量组间无明显统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组CVA模型豚鼠血清及BALF中TGF-β mRNA及MMP-9 mRNA表达的比较

2.4 加味六安煎对CVA模型豚鼠气道重塑程度的影响

2.4.1 胶原面积 经单因素方差分析，F=15.826，P<0.01(P=0.000)，可以认为6组豚鼠胶原面积不完全相同。与正常对照组相比，模型组胶原面积明显增加(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组及加味六安煎各剂量组胶原面积减小，且有统计学差异(P<0.05)；与孟鲁司特钠组相比，加味六安煎各剂量组胶原面积均有不同程度的减小，且有统计学差异(P<0.05)，加味六安煎各剂量组组间相比无显著性差异(P>0.05)。见表3。

2.4.2 组织总面积 经单因素方差分析，F=1.343，P=0.280(P>0.05)，6组豚鼠组织总面积无显著性差异。见表3。

2.4.3 胶原容积分数 经单因素方差分析，F=21.699，P<0.01(P=0.000)，可以认为6组豚鼠CVF不完全相同。与正常对照组相比，模型组CVF明显升高，且有统计学差异(P<0.05)；与模型组相比，孟鲁司特钠组及加味六安煎各剂量组CVF均有不同程度降低(P<0.05)；与孟鲁司特钠组相比，加味六安煎各剂量组CVF均有不同程度降低(P<0.05)；加味六安煎各剂量组之间无显著性差异(P>0.05)。见表3及图1。

表3 各组CVA模型豚鼠胶原面积、组织总面积及CVF比较

3 讨论

在中医学中，CVA多被归为“风咳”“哮咳”范畴，病位在肺，病因多责之于风、痰、虚、瘀，中医药治疗本病具有较好的优势[5]。基于小儿肺脾不足的生理特点，课题组认为肺脾气虚、痰饮伏肺为本病的基本病机。小儿肺常不足，卫外不固，腠理疏松，易为外邪侵袭，故而往往内外相合而为病。加味六安煎全方由法半夏、橘红、茯苓、杏仁、白芥子、甘草、海浮石、葶苈子、瓜蒌、胆南星、炒莱菔子组成，清热泻肺，健脾化痰。本病往往反复发作，迁延不愈，所谓“久病入络，痼病必瘀”，正如唐容川在 《血证论》中提出 “一切不治之症，终以不善祛瘀之故……瘀血内蓄可使久病缠绵不愈”，故而加桃仁、地龙、丹参等活血通络之品，临证辨治显效。有研究表明，活血化瘀法可以通过调节VEGF的表达从而调节新生血管的生成[6]。同时有临床研究表明，CVA患儿的VEGF表达水平明显升高，增加了血管的通透性，影响着细胞外基质的改变，进而影响CVA患儿的气道重塑[7]。故而CVA气道重塑与“瘀”密切相关，在治疗本病时，活血化瘀通络法当得到重视。

注：A 正常对照组；B 模型组；C 孟鲁司特钠组；D 加味六安煎低剂量组；E 加味六安煎中剂量组；F 加味六安煎高剂量组。

虽然本病的具体发病机制尚未明确，但与哮喘有共同的病理基础，其中气道炎症和气道重塑是两个重要方面。IL-4及IL-13是导致本病气道炎症的重要因子。IL-4由T淋巴细胞亚群Th2及嗜酸性粒细胞分泌，位于易引起哮喘发生的核酸区段(5q31-5q33和5q23-5q31)[8]，可以通过转录Fc RII mRNA，从而表达Fc RII，进而合成IgE，可以介导肥大细胞、B细胞增殖，促进IgM向IgE转换，联合集落刺激因子表达血管内皮细胞黏附分子，从而促进气道嗜酸性粒细胞炎症浸润和损伤[9]，是导致本病慢性炎症的重要细胞因子之一，对于调节体内的免疫应答具有重要的作用[10]。本次研究发现CVA模型组豚鼠的血清及BALF中IL-4水平低于正常对照组，加味六安煎低、高剂量组血清IL-4水平有所升高。似乎与既往多数研究矛盾，这可能与多种因素相关。第一，CVA相当于哮喘的隐匿期，从激发造模即日至给药治疗干预，CVA豚鼠可能处于“平稳期”，此时期的IL水平紊乱程度较轻，可能与正常对照组相当。豚鼠对于致敏原的敏感性较高，在以后的实验研究中，考虑以给药为时间节点，对CVA豚鼠的急性激发状态和“平稳期”的IL-4水平进行比较。第二，可能与样本采集有关，本次研究发现CVA模型组BALF中的IL-4水平较血清中的水平高，在激发状态下，炎症因子聚集于肺组织局部，气道白介素水平可能异常，而外周血中特异性炎症细胞水平下降。从而血清中IL-4水平下降。随着时间的推移，炎症因子逐渐扩散到外周血液循环中，故可能会有所升高。与CVA模型组相比，加味六安煎各剂量组BALF中的IL-4水平虽无统计学差异，但均呈降低趋势，由此可见IL-4在CVA模型豚鼠局部肺组织的含量与外周血中的含量存在明显的差异，且经治疗后BALF中的IL-4水平降低程度比血清更明显。此外，培养条件、时间等多种条件也可能是影响IL检测的因素。IL-13是由Th2细胞产生，是参与气道炎症反应的中药细胞因子[11]。同时，既往有研究[12-13]表明，IL-13是重要的诱导黏液分泌的上游细胞因子，可诱导嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等趋化，促进B细胞产生IgE，从而刺激气道上皮杯状细胞分泌黏液，并可以诱导支气管平滑肌细胞分泌VEGF[14],在气道重塑的过程中也发挥着重要的作用。在本研究中，CVA模型组的IL-13的水平较正常对照组明显升高，与既往研究具有一致性，由此可见IL-13对CVA气道黏液分泌程度及气道重塑程度有重要的影响。经过给药治疗后，孟鲁司特钠组IL-13水平与模型组无显著性差异，加味六安煎各剂量组IL-13水平较模型组及孟鲁司特钠组降低，由此可见加味六安煎对IL-13水平的降低程度较孟鲁司特钠组明显，其中以加味六安煎中剂量组降低最明显。

气道重塑在慢性气道炎症的基础上，随着炎症的迁延和反复加重，在多种炎症细胞及其释放出的细胞因子和炎症介质的作用下，气道上皮发生基底膜增厚、腺体肥大增生、平滑肌增生肥厚和新血管形成等病理改变。TGF-β、MMP-9是气道重塑重要生物标志物[15]。MMP-9属于细胞外蛋白酶家族，可以降解细胞外基质，同时又可以促进气道平滑肌的增殖，并促进上皮细胞分泌TGF-β。TGF-β是一种促纤维细胞生长因子，可引起气道上皮纤维化，平滑肌增生，微血管改变，黏液分泌增加。本次研究发现模型组肺组织及BALF中TGF-β mRNA和MMP-9 mRNA的表达水平升高，加味六安煎可以降低二者的表达，基本与既往研究相符。

胶原沉积增加是气道重塑的重要病理表现[16]。在本次研究中，CVA模型组的胶原面积和CVF较正常对照组增加，各治疗组的胶原面积及CVF均有降低，且加味六安煎各剂量组的胶原面积及CVF均较孟鲁司特钠组有不同程度的降低，提示加味六安煎对于CVA豚鼠气道重塑的改善程度优于孟鲁司特钠组。基础数据比较，加味六安煎中剂量组对胶原面积及CVF的减低程度最明显。既往本课题组对CVA模型Wistar大鼠进行了初步研究[17]，发现各治疗组间对于胶原沉积程度的改善程度无统计学差异，加味六安煎各剂量组组间比较，高剂量组对于胶原沉积的改善情况最明显，这可能与Wistar大鼠与豚鼠对治疗药物的敏感性差异有关，由此可见CVA模型豚鼠比CVA模型Wistar大鼠对治疗药物更敏感。

综上，加味六安煎治疗CVA可能通过调节IL-4和IL-13水平，进而调整Th1/Th2的平衡状态，减轻气道炎症程度；并通过调节TGF-β mRNA和MMP-9 mRNA的表达，减轻气道胶原沉积状态，进而改善气道重塑。