基于凋亡机制院内制剂抗瘤丸优化方-4对U87裸鼠移植瘤动物模型实验研究

冯英楠 陈菲 王晓萌 王海征 林晓兰

胶质瘤是中枢神经系统最常见的一类肿瘤，约占颅内所有肿瘤的35.26%～60.9%[1]。胶质瘤具有侵袭性生长、恶性程度高等特点。目前，治疗神经胶质瘤主要采取手术为主，辅助放疗、化疗等方法，但是胶质瘤生存期短，死亡率高，对人类健康威胁极大。中药因其较好的安全性和有效性在肿瘤的治疗中发挥积极作用，抗瘤丸是适用于脑胶质瘤、脑垂体瘤的辅助治疗的院内制剂，临床应用近30年，服用的患者累计10万余人次，于2012年获得国家发明专利(专利号：ZL 2010 1 0234220.2)。

课题组前期研究也证实，抗瘤丸的抑制神经胶质瘤细胞作用可能与诱导胶质瘤细胞的凋亡相关[2-3]，提示对治疗胶质瘤有良好的开发和应用前景。抗瘤丸优化方-4是抗瘤丸的优化处方之一，基于前期优化处方研究[4-5]发现，本实验的抗瘤丸优化方-4抑瘤效果较好，故本实验进一步对抗瘤丸优化方-4进行研究。抗瘤丸优化方-4是在原方的基础上，通过中医药专家论证，减少了6味佐使药。本实验通过观察对相关指标表达的影响，进一步阐明抗瘤丸优化方-4治疗胶质瘤的作用机制，为抗瘤丸处方优化提供数据，为进一步开发抗瘤丸提供相关的实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物与细胞

SPF级健康雄性BALB/c裸鼠，雄性，体质量17～19 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001；人神经胶质瘤U87细胞(株)，购于中国协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心(ATCC，CCL-107)。

1.2 药物

抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝莲、白英等18味中药组成的院内复方制剂。抗瘤丸优化方-4是抗瘤丸的优化处方，由首都医科大学宣武医院药剂科提供。阳性对照药替莫唑胺(批号：H20080313)，购于美国先灵葆雅制药公司。

1.3 试剂及仪器

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(批号：20120517)，购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；DMEM培养基(高糖)(批号：1177237)、胰蛋白酶(批号：0458)、无钙、镁磷酸盐缓冲液(10×PBS，PH 7.2-7.4)(批号：20120815)，均购于北京诺博莱德科技有限公司；注射用青霉素钠(批号：Y0302215)、注射用硫酸链霉素(批号：030103)，购于华北制药股份有限公司；CD34抗体、兔抗人原始造血细胞单克隆抗体(批号：12620110)，购于北京中衫金桥生物技术有限公司；VEGF抗体、rabbit IgG(批号：10CM199)，购于武汉博士德生物工程有限公司；二抗、(H+L)/HRP辣根酶标记山羊抗兔(批号：K126816A)、DAB浓缩显色液、A液和B液(批号：ZLI-9018)、原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(批号：12469600)，均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

6500型CO2培养箱(美国NAPCO)，TE2101L型电子天平(德国赛多利斯)，倒置显微镜(日本OLYMPUS)，DM3000显微镜(德国Leica)。

1.4 人神经胶质瘤U87细胞的培养方法

U87细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置37℃、5%CO2的培养箱中，培养基2～3天更换一次，倒置显微镜下观察细胞的生长情况。当细胞生长至70%～80%融合时进行传代，用0.25%胰蛋白酶消化液进行消化传代，将培养基倒掉，用PBS洗两遍，加消化液室温下消化，倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞开始变圆，细胞间隙变大时，加入10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打瓶底和瓶壁，按1瓶传3瓶的比例接种，3到4天传代一次。

1.5 模型制备

将U87细胞(5×107个细胞/只)接种到裸鼠(2只)右侧腋窝、20天瘤块长至2 cm(直径)，无菌剥离肿瘤成2 mm×2 mm×2 mm，用套管针将瘤块移植至裸鼠(10只)右侧腋窝，用火棉胶将切口粘住。17～19天再次长至2 cm(直径)，无菌剥离肿瘤成1 mm×1 mm×1 mm，再次移植裸鼠右侧腋窝，用火棉胶将切口粘住。

1.6 分组与给药

待动物体内瘤块长至80～180 mm3时，将裸鼠按瘤块大小和体质量采用分层随机抽样方法分为：模型组、阳性药(替莫唑胺)对照组、抗瘤丸优化方-4高、中、低剂量组，每组12只。抗瘤丸优化方-4高、中、低剂量组药物浓度分别为3.4 g、1.7 g、0.85 g生药/kg，替莫唑胺胶囊药物浓度为43 mg/kg。各药物组按25 mL/kg灌胃给药，模型组给予等体积去离子水，每天1次，连续给药20天。

1.7 指标检测

给药20天后处死裸鼠，取各组裸鼠的瘤块，CD34免疫组化法染色，Weidner法计数微血管密度(microvascular density，MVD)；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)免疫组化法染色，图像分析测定灰度值。TUNEL法检测凋亡细胞，计算肿瘤细胞凋亡率。

1.7.1 MVD检测 取出经10%福尔马林固定，每组随机取3个瘤块，常规石蜡包埋、切片(每个肿块切3张片子：第1切片取肿瘤最外侧边缘，第2切片取肿瘤正中，第3切片取前两切片中间位置，厚度为4 μm)。CD34：(1)切片在65℃烤箱中烤片2小时，常规脱蜡至水后PBS缓冲液洗2分钟×5次；(2)3% H2O2室温下孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液洗2分钟×5次；(3)0.01M柠檬酸缓冲液(PH=6.2)中进行抗原热修复，高压锅中高温高压修复2小时，自然冷却后PBS缓冲液洗2分钟×5次；(4)室温下5%山羊血清封闭非特异性背景10分钟，PBS缓冲液洗2分钟×5次；(5)分别加CD34一抗(抗体用PBS稀释，稀释倍数1∶100)和VEGF一抗(抗体用PBS稀释，稀释倍数1∶20)，4℃孵育过夜，PBS缓冲液洗2分钟×5次；(6)物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育30分钟，PBS缓冲液洗2分钟×5次；(7)DAB显色3～5分钟，苏木精复染2分钟，清水冲洗干净，盐酸酒精快速分化，清水返蓝5分钟，逐级梯度酒精脱水、二甲苯透明，树脂封片。

MVD计数参照Weidner法如下：先在100倍下观察整个切片，每张切片找出3个微血管密集区，血管内皮细胞被染成棕色，然后在200倍镜下计数被CD34染色的微血管数目。微血管判断标准如下：与邻近的微血管、肿瘤细胞及其它结缔组织成份不相连的、标记清晰的内皮细胞及内皮细胞簇均可作为一个可计数的微血管。同一微血管的内皮细胞，如染色清晰且相互分离，也可作为单独的微血管计数。血管腔及腔内红细胞的存在不是确认微血管的必备条件，对管腔直径大于8个红细胞或管壁有平滑肌存在的血管不进行计数。

1.7.2 VEGF灰度值检测 VEGF免疫组化染色程序同CD34，每组选9张切片，用Leica DM显微镜在同一条件下观察，每张切片上随机选3个视野，通过Leica CAMER图像采集系统(Lecia Qwin V3)采集图像，分析测定每个视野内30个免疫阳性反应的灰度值。VEGF阳性判定如下：VEGF为细胞浆着色，染色阳性以细胞浆呈棕色颗粒状为标准，且着色明显高于背景。灰度分为0～256级，反映不同的免疫阳性反应着色强弱。测量所得灰度值越小，阳性表达越强。

1.7.3 细胞凋亡率检测 取材、包埋、切片同CD34和VEGF，石蜡包埋切片后采用TdT介导的TUNEL法检测凋亡细胞，具体操作按说明书进行。具体步骤如下：(1)切片常规脱蜡，二甲苯浸洗5分钟×2次，梯度乙醇浸洗3分钟×1次；(2)PBS漂洗2次，用proteinase K工作液处理组织15～30分钟；(3)PBS漂洗2次，加入制备TUNEL反应混合液(处理组用50 μL TdT+450 μL荧光素标记的dUTP液混匀，模型组仅加50 μL荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100 μL DNase I，反应10分钟，后面步骤同处理组；(4)加50 μL TUNEL反应混合液(模型组仅加50 μL荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片在暗湿盒中37℃反应1小时；(5)PBS漂洗3次，加50 μL converter-POD于标本上，加盖玻片在暗湿盒中37℃反应30分钟；(6)PBS漂洗3次，加50 μL DAB底物，反应在10分钟；(7)PBS漂洗3次，苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

TUNEL染色切片观察与分析:在Leica光学显微镜下观察TUNEL染色，每组共取9个切片，每张切片在200倍视野下选取3个视野，计数TUNEL阳性细胞数和正常细胞数。凋亡细胞可见核中有棕褐色颗粒，凋亡细胞体积缩小，染色体断裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小体，正常细胞核呈蓝色。统计凋亡阳性细胞所占的比例，计算肿瘤细胞凋亡率。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组U87裸鼠肿瘤组织MVD检测

与模型对照组比较，抗瘤丸优化方-4低剂量组、阳性药对照组的MVD值明显降低(P<0.05)。经免疫组化法染色显示，CD34低表达。见表1、图1。

图1 各组U87裸鼠肿瘤组织中CD34的表达(DAB，×200)

表1 给药20天后各组U87裸鼠肿瘤组织MVD比较

2.2 各组U87裸鼠肿瘤组织VEGF检测

与模型对照组比较，抗瘤丸优化方-4高、中、低剂量组、阳性药对照组移植瘤灰度值明显增高(P<0.05)。经免疫组化法染色显示，VEGF低表达。见表2、图2。

图2 各组U87裸鼠肿瘤组织中VEGF的表达(DAB，×200)

表2 给药20天后各组U87裸鼠肿瘤VEGF灰度值比较

2.3 各组U87裸鼠肿瘤细胞凋亡率检测

与模型对照组比较，上述给药组细胞凋亡率显著增高 (P<0.05)。经TUNEL染色，模型对照组可见少量呈棕褐色的凋亡细胞，抗瘤丸优化方-4高、中、低剂量组、阳性药对照组可见大量的凋亡细胞，具有明显的促进肿瘤细胞凋亡的作用。见表3、图3。

表3 给药20天后各组U87裸鼠肿瘤细胞凋亡率比较

图3 各组U87裸鼠肿瘤组织中的凋亡细胞TUNEL染色(×200)

3 讨论

中医认为胶质瘤的发生与痰湿凝聚、气滞血瘀、肝肾不足密切相关，主要治疗法则是活血化瘀、扶正培本、健脾补肾、化痰软坚[6]。抗瘤丸是由18味中药组成的院内制剂，其中君药具有清热利湿、活血化瘀的功效。臣药配伍君药起到清热解毒，豁痰开窍的功效。白英等清热利湿，解毒消肿；川贝母等润肺祛痰开胸，利肺气，通调水道以使痰湿下行；炒山楂等健脾开胃，可消食化积散瘀，防君臣之药伤及脾胃。全方配伍共奏清热解毒，活血化瘀，化痰散结之功。前期临床研究表明，KLW可延长恶性胶质瘤患者的生存时间，具有肯定疗效，且价格低廉，有较好的开发价值和前景[7]。

MVD是指生物组织如皮肤、肌肉、器官等组织中单位密度的微血管数量。MVD在临床上应用于恶性组织微血管新生、侵袭性以及预后评估的诊断，可以反映肿瘤的生长转移[8]。VEGF是肿瘤血管生成的重要因子，与肿瘤发生、发展、转移有密切关系[9]。王奕丹等[10]研究MVD与胶质瘤的恶性程度呈正相关,与患者的术后生存时间呈负相关。李娜等[11]研究通过下调VEGF表达，抑制了新生血管的生成，阻断其营养供应，抑制肿瘤增殖，进而发挥其抑制肿瘤侵袭转移的作用。抗瘤丸中白花蛇舌草、半枝莲、白英等成分已有大量的药理学实验证明了抗瘤机制。其中白花蛇舌草可以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增值[12]；半枝莲能抑制肿瘤血管生成与转移[13]；白英可通过调控VEGF相关信号通路诱导A549细胞的凋亡[14]。实验结果显示，抗瘤丸优化方-4能够抑制VEGF的表达，降低MVD，从而抑制肿瘤组织新生血管形成，同时可以促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述，抗瘤丸优化方-4对胶质瘤有一定的作用效果，其作用机制可能与促进肿瘤细胞凋亡，抑制VEGF的表达相关，为抗瘤丸的进一步开发提供实验依据。