HPLC法测定斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠的含量*

邢亚东，罗凯文，马康，李姗姗

1.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233030；2.悦康药业集团安徽天然制药有限公司，安徽 太和 236600

斑蝥酸钠注射液收载于《化学药品地方标准上升国家标准品种名单》中［1］，属于抗肿瘤药，该药可直接进入肝癌细胞核及核仁内，抑制癌细胞内DNA和RNA合成，影响癌细胞的核酸代谢，继而使癌细胞形态和功能发生变化，杀死癌细胞，主要用于原发性肝癌、肺癌等癌症的治疗［2-4］。斑蝥酸钠主要用于白细胞低下症及肝炎、肝硬化、乙型肝炎［5-7］，临床应用较为广泛。因斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠的原标准检测方法为气相色谱法（gas chromatography，GC），具体过程为“以甲基硅胶（SE-30）为固定液，涂布浓度为10%；柱温为180℃；氯仿溶解正十六烷，作为内标溶液。取斑蝥素对照品适量，精密称定，加内标液适量，氯仿定容，作为对照品溶液。精密量取本品适量置锥形瓶中，加1 mol·L-1硫酸，氯仿萃取3次，每次10 min；萃取液合并，70℃水浴挥去氯仿至约5 mL，精密加内标液1 mL。混匀，转移至10 mL量瓶中，用氯仿稀释至刻度，摇匀，即为供试品溶液。测定，记录色谱图，以峰面积按内标法计算含量，再乘以1.316，即得。”［1］该过程使用的GC价格昂贵、操作较为繁琐；样品处理过程相对复杂、所用试剂毒性及危险性较大，在萃取过程中目标成分易损失，同时该检测过程对检测人员的整体素质要求较高。关于使用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠的含量无相关的报道［8-10］。为确保药品在临床使用中剂量更加精确以及药品在生产过程中尽量减少对环境的污染，需要建立稳定、简便、经济的检测方法控制该药品的质量。现采用HPLC法定量测定斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠的含量，可为斑蝥酸钠注射液的质量控制提供参考依据。

1 材料

1.1药物与试剂斑蝥酸钠对照品（纯度：99.0%，上海景荣化学科技有限公司，批号：20190930）；斑蝥酸钠维注射液（悦康药业集团安徽天然 制 药 有 限 公 司，批 号：19051201、19051202、19051203、19072101、19072102、19072103、19090601、19090602、19090603、19121401、19121402、19121403，规格：每支10 mL，每支含斑蝥酸钠0.5 mg）；甲醇、乙腈均为色谱纯（TEDIA COMPANY，INC.），其余试剂均为分析纯。

1.2仪器UltiMate3000型高效液相色谱仪（配置包括自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器，美国赛默飞公司），GC2010plus气相色谱仪（日本岛津公司）；BT125D型十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；Esw Plus10型超纯水机（上海茸研仪器有限公司）；IKA RV 10 digital V型旋转蒸发仪（IKA Germany）；XZ133-SB-800D型高功率数控超声波清洗器（北京中西远大科技有限公司）。

2 方法

2.1色谱条件采用Phenomenex C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），流 动相为 乙腈-0.02 moL·L-1磷酸二氢钾，等度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，进样量10μL，检测波长230 nm。

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取斑蝥酸钠对照品适量，加纯水溶解并定容，制备成浓度为0.661 9 g·L-1的对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备 精密量取样品溶液100 mL，60℃旋蒸浓缩至约5 mL，浓缩液转移至10 mL棕色量瓶内并加水定容，即得。避光保存。

3 结果

3.1系统适应性实验在室温条件下，分别取斑蝥酸钠对照品、供试品溶液适量，按色谱条件进样，记录色谱图，见图1。供试品和对照品溶液色谱图相对应的位置上有相同的吸收峰。理论板数按斑蝥酸钠计均大于6 000，斑蝥酸钠与其他相邻峰之间的分离度满足ChP相关要求。

图1 斑蝥酸钠注射液色谱图

3.2线性关系的考察分别精密量取“2.2”项下斑蝥酸钠对照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL注入高效液相色谱仪，记录斑蝥酸钠峰面积。以峰面积为纵坐标、进样量（μg）为横坐标进行线性回归，得斑蝥酸钠回归方程分别为Y＝0.753 3X＋0.062 0（r＝0.999 8）。结果表明斑蝥酸钠在1.323 8～6.619 0μg范围内线性关系良好。

3.3精密度实验精密吸取浓度为0.661 9 g·L-1斑蝥酸钠对照品溶液10μL，连续进样6次，记录斑蝥酸钠峰面积，得出RSD值为0.64%，表明仪器精密度良好。

3.4稳定性实验取同一供试品溶液（批号：19051201）适量，按色谱条件分别在0 h、1 h、3 h、6 h、15 h、24 h重复进样一次，记录斑蝥酸钠峰面积，RSD值为1.17%。结果表明斑蝥酸钠在该条件下24 h内稳定。

3.5重复性实验取同一批号（批号：19051201）供试品适量，按样品制备方法平行制备供试品溶液6份。按色谱条件进样分析，记录斑蝥酸钠峰面积，RSD值为0.83%。结果表明方法重复性良好。

3.6加样回收率实验取已知含量的斑蝥酸钠注射液（批号：19051201）样品15份，分3组，每份约50 mL，精密量取，置于100 mL量瓶中，再分别精密加入一定量的斑蝥酸钠对照溶液（分别相当于含量的80%、100%、120%的量）并加水定容，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述测定含量的方法测定，记录峰面积，计算得斑蝥酸钠的平均回收率为98.51%，RSD为0.96%（n＝15）。结果表明该法加样回收率良好。见表1。

表1 斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠加样回收率实验结果 （n＝15）

3.7样品含量测定取收集的12批斑蝥酸钠注射液适量，精密量取适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按相应色谱条件进样测定并记录斑蝥酸钠峰面积，计算斑蝥酸钠含量，同时按国家相应的原标准检测方法（GC法）对12批样品中斑蝥酸钠的含量进行测定，结果见表2。

表2 含量测定结果 （n＝3）

4 讨论

斑蝥酸钠为斑蝥素的衍生物，与斑蝥素比较，其抗肿瘤疗效确切，不良反应较少［11-13］，可有效改善放、化疗的不良反应，提高肿瘤患者的免疫功能及生存质量，为临床常用药［14-16］。但斑蝥酸钠注射液收载的检测方法为GC法，该法制备样品较为复杂，目标成分易损失，而其他的检测方法报道较少。针对上述存在的问题，本实验建立了HPLC法测定斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠的含量，并对所建立的相关实验条件进行摸索与优化，从而为其质量控制提供参考依据。

对斑蝥酸钠在紫外条件下进行全波长扫描，发现其在193 nm和230 nm处有最大吸收，对样品使用193 nm波长进行含量测定时，基线波动不利于整个测定过程的顺利进行，而230 nm波长时基线较稳，更有利于检测过程的进行。因此，选择230 nm作为检测波长。

采用HPLC法测定斑蝥酸钠的文献较少，故本次实验分别摸索了甲醇、乙腈-水［17-20］；乙腈-0.02 moL·L-1磷 酸 二 氢 钾 溶 液［21-24］；乙 腈-0.1%磷酸（三乙胺调pH为2.80）［25-28］；乙腈-0.1%磷酸水溶液［29-30］；乙腈-0.005 moL·L-1辛烷磺酸钠溶液（用H3PO4调pH为2.50）等流动相体系［31］。结果发现，含甲醇的流动相体系对实验有干扰，原因可能为甲醇存在末端吸收，斑蝥酸钠在乙腈-0.1%磷酸（三乙胺调pH为2.80）；乙腈-0.1%磷酸水溶液；乙腈-0.005 moL·L-1辛烷磺酸钠溶液体系中峰型的对称度较差，拖尾严重；且辛烷磺酸钠属于大分子物质，在流动相的制备和使用过程中容易产生气泡，不利于整个实验的进行和仪器的保护，在乙腈-0.02 moL·L-1磷酸二氢钾溶液体系中保留时间较为合适、峰型较好、柱效较高，有利于整个检测实验的顺利进行。

本实验根据样品的实际情况建立的HPLC法测定斑蝥酸钠注射液中斑蝥酸钠含量只需对样品溶液进行简单的浓缩、定容，样品处理过程简单、方便、易操作，仪器使用简便，且测定结果较为稳定。所建立的方法与原标准中收载的方法相比存在一定的优势，该方法可用于对斑蝥酸钠注射液质量进行控制，为进一步改进斑蝥酸钠的检测方法奠定了一定的基础。