芍药甘草附子汤调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎的临床研究*

暴丁溯，郭晓光，覃波，刘刚，曾胜强

西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）发病率日益升高［1-4］，研究表明［5-7］，软骨细胞的死亡和细胞外基质的丢失是关节软骨退变和KOA病情进展的关键。自噬作用是机体细胞在损伤及生存压力下，通过吞噬消化异常细胞内产物，抑制凋亡作用，适应环境压力，使自身存活的机制［8-9］。最近研究表明，提高软骨细胞自噬作用可延缓骨性关节炎（Osteorathritis，OA）的病情进展［10-11］。《伤寒论》芍药甘草附子汤具有补益肝肾、温经通脉、扶阳益阴的作用，是治疗KOA的经典方剂之一，临床疗效确切，但其作用机制尚不清楚［12-13］。基于自噬作用在KOA疾病进展中的重要作用，芍药甘草附子汤可能参与调节软骨细胞的自噬作用，进而发挥其治疗KOA的疗效。

本研究拟通过检测、对比干预前后关节腔炎症因子、软骨细胞凋亡水平及自噬相关基因的变化，探索芍药甘草附子汤治疗KOA的机制。

1 资料与方法

1.1一般资料所有患者均为2017年1月至2019年12月在西南医科大学附属中医医院骨伤科就诊的KOA患者，共40例，随机分为对照组和试验组各20例，对照组男10例，女10例；年龄（63.30±3.89）岁；病程（38.15±6.61）个月；VAS评分（5.40±0.94）分。试验组男12例，女8例；年龄（62.85±3.28）岁；病程（35.70±5.63）个月；VAS评分（5.45±1.00）分。两组患者性别、年龄、病程、VAS疼痛评分和膝关节屈伸活动度等比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2诊断标准参照《中国骨关节炎诊治指南（2007年版）》诊断标准，符合膝骨关节炎Kellgren-Lawrence分级III级：①近1个月反复膝关节疼痛；②X线表现为关节间隙狭窄、软骨下骨硬化、关节边缘骨赘形成；③关节液（至少2次）清亮，白细胞计数（white blood cell count，WBC）小于2 000个·mL-1；④年龄≥55岁；⑤活动时有骨摩擦音（感）。

1.3病例纳入标准年龄55～80岁，符合膝骨关节炎诊断标准；无明显膝关节损伤史；无脑中风后遗症病史；无下肢麻木及下肢功能障碍疾病；无下肢及髋部骨折病史；近半年未服用过影响肌肉功能的药物；X线检查K-L分级标准为III级；患者及家属知情同意；患者依从性良好，自愿配合相关治疗，可顺利完成术后康复及随访，签署知情同意书。

1.4病例排除标准继发性OA患者，如因外伤、感染、肿瘤、结核等引起的关节病变；由于神经疾患而影响肌肉含量及肌力改变者；患有先天性及遗传性骨病者；慢性胃肠道疾病，无法口服塞来昔布者；依从性较差，无法完成随访者。

1.5治疗方法对照组口服塞来昔布胶囊0.5 g，日2次，盐酸氨基葡萄糖0.48 g，日3次。试验组在对照组治疗的基础上采用芍药甘草附子汤治疗，药物组成：芍药9 g，炙甘草9 g，炮附子3 g。日1剂，水煎，分2次温服（药物由西南医科大学附属中医医院中药房提供）。两组均以28 d为1个疗程。

两组在口服药物治疗28 d后，行膝关节镜检清理术加去神经化治疗和微骨折治疗术。手术步骤：腰硬膜外麻醉成功后，患者取仰卧位，大腿根部安置止血带，术区常规10%聚维酮碘消毒3遍后，铺无菌单及防水单。下肢抬高，止血带加压至220 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa），取膝关节外侧切口，髌下1.5 cm，髌腱旁1 cm，穿刺针进入关节腔后，可见关节液流出，进镜观察见：膝关节腔内滑膜增生，关节可见少量游离体，内外侧半月板磨损、边缘毛糙，部分患者可合并半月板撕裂，髌骨、内外侧股骨髁负重区软骨剥脱磨损，前后交叉韧带张力可，股骨髁非负重区取少许软骨。关节镜下清理增生滑膜，蓝钳及刨刀修整半月板白区，恢复半月板月牙形，清理取出关节腔游离体，取出部分剥脱软骨送检，并用刨刀刨除股骨髁及胫骨平台剥脱软骨，微骨折工具局部微骨折治疗，可见骨髓液少量流出，再次清理关节腔，等离子电凝彻底止血，检查无明显活动性出血后，将关节内积液排尽，缝合伤口，关节腔内注射罗哌卡因注射液，无菌纱布覆盖，加压包扎，松止血带，患肢弹力绷带固定，手术结束。

术后给予预防感染、消肿止痛、间断冰敷、抗凝预防血栓治疗，术后第二天开始活动。术后3 d在专业康复师指导下行膝关节主动及被动活动，2～3 d换药1次，术后14 d拆线。术后1个月、3个月、6个月、12个月定期门诊随访。

1.6观察指标治疗前后采血及抽取关节腔积液行生化检查，术中取非负重区部分软骨行自噬相关蛋白检测。观察患者治疗前后C反应蛋白、血沉、膝关节活动度及视觉模拟评分法（visual analogue scale，VAS）疼痛评分。采用ELISA法检测血清及关节液中白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达水平；采用免疫印迹法检测软骨自噬相关蛋白PI3K、pAkt、pmTOR和Beclin1的表达水平。术后4周评估膝关节屈伸活动度及VAS疼痛评分。

1.7统计学方法数据分析采用SPSS 22.0软件进行处理，频数资料采用χ2检验；计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组KOA患者治疗前后VAS疼痛评分比较两组患者治疗后VAS疼痛评分明显降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组评分低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组KOA患者治疗前后VAS疼痛评分比较 （±s，分）

表1 两组KOA患者治疗前后VAS疼痛评分比较 （±s，分）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，＃P＜0.05

治疗前 治疗后对照组 20 5.40±0.94 2.30±0.86组别 n*试验组 20 5.45±1.00 1.65±0.75*＃

2.2两组KOA患者治疗前后膝关节屈伸活动度比较两组患者治疗后膝关节屈曲度升高，伸直度降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组治疗后膝关节屈曲度与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），伸直度与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组KOA患者治疗前后膝关节屈伸活动度比较 （±s，°）

表2 两组KOA患者治疗前后膝关节屈伸活动度比较 （±s，°）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，＃P＜0.05

屈曲度伸直度组别 n治疗前 治疗后对照组20 77.80±10.62 91.75±9.00*13.70±2.60 5.40±1.85治疗前 治疗后*试验组20 73.45±11.61 113.35±9.70*＃15.35±3.12 4.55±2.01*

2.3两组KOA患者治疗前后血沉及C反应蛋白水平比较两组患者治疗后血沉及C反应蛋白水平均降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组KOA患者治疗前后血沉及C反应蛋白水平比较 （±s，mm·h-1）

表3 两组KOA患者治疗前后血沉及C反应蛋白水平比较 （±s，mm·h-1）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，＃P＜0.05

反应蛋白对照组20治疗前组别 n 时间 血沉 C 33.78±7.95 27.65±4.51 20治疗后 15.29±3.73* 8.39±1.53*试验组20治疗前 33.21±7.52 28.60±3.40 20治疗后 11.19±3.49*＃ 6.37±2.17*＃

2.4两组KOA患者治疗前后血清及膝关节穿刺液中IL－1和TNF－α水平比较两组患者治疗后IL-1和TNF-α均明显降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两组KOA患者治疗前后血清及膝关节穿刺液中IL－1和TNF－α水平比较 （±s，μg·L-1）

表4 两组KOA患者治疗前后血清及膝关节穿刺液中IL－1和TNF－α水平比较 （±s，μg·L-1）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，＃P＜0.05

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2.5两组KOA患者治疗后软骨自噬相关蛋白PI3K、pAkt、mTOR、Beclin－1表达比较治疗后，试验组自噬相关蛋白PI3K、pAkt、mTOR、Beclin-1表达与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 两组KOA患者治疗后软骨自噬相关蛋白PI3K、pAkt、mTOR、Beclin－1表达比较 （±s）

表5 两组KOA患者治疗后软骨自噬相关蛋白PI3K、pAkt、mTOR、Beclin－1表达比较 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

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3 讨论

膝骨关节炎以膝关节软骨退变磨损为主要病理特点，主要表现为膝关节长期慢性疼痛、活动受限，晚期可出现下肢力线异常，内外翻畸形，严重影响患者的患肢功能和生活质量［14-16］。针对KOA的治疗，早中期以非甾体抗炎药、营养软骨、体质量控制为主，若存在明显的下肢力线异常，则进行力线纠正；存在明确的半月板损伤可进行膝关节镜下修整成型缝合手术，延缓膝关节软骨退变进程，改善患者关节疼痛症状；晚期则进行膝关节置换，根据患者的病变间室可进行髌骨关节置换，内外侧单髁置换和全膝关节置换；由于膝关节翻修手术难度大、费用高、并发症多等不足，在进行初次人工膝关节置换时，应将膝关节置换的时间尽可能往后推迟，尽可能避免膝关节翻修［17-19］。针对早中期的KOA，目前治疗方法较多，但疗效尚不明确，探索疗效更为确切的保膝治疗方案，依然是现阶段骨伤科研究领域的热点之一。

自噬作用是细胞在面临外界损伤刺激或者生存压力时，从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜结构，包裹损伤或老化的细胞器、异常蛋白质等大分子成分形成自噬体，并与溶酶体融合降解再循环，实现大分子蛋白质的代谢及部分细胞器的更新，以维持细胞正常新陈代谢，使细胞本身适应恶劣环境变化，抑制凋亡机制，并存活下来［20］。自噬作用已被发现在参与人体心脑血管代谢、内分泌调节、肿瘤治疗、免疫调节等多个系统中发挥着至关重要的作用［21-24］。最新研究表明，自噬在参与调节关节软骨细胞凋亡方面起着至关重要的作用［25］。启动自噬作用，可提高关节软骨细胞应对损伤的能力，减少软骨细胞凋亡，改善膝骨关节炎的疾病发展进程。

本课题提出KOA治疗原则为补益肝肾，温经通脉，扶阳益阴，《伤寒论》芍药甘草附子汤由芍药、炙甘草、附子三药组成，芍药活血、柔肝，通脉，炙甘草补脾养血，附子温肾助阳。诸药合用，温肾通脉，通络缓急，复阳益阴，用于治疗阴阳两虚，肌肤失温，筋脉失养之证，契合膝骨关节炎病机。

本研究结果表明，两组患者治疗后VAS疼痛评分明显降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组评分低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者治疗后膝关节屈曲度升高，伸直度降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；试验组治疗后膝关节屈曲度与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），伸直度与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者治疗后血沉及C反应蛋白水平均降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者治疗后IL-1和TNF-α均明显降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

目前有研究表明，KOA的发生是机体PI3K／AKt／mTOR信号通路激活后，导致下游多种效应分子的活化状态，进而抑制自噬作用，导致的病变过程［26-27］。Beclin1是PI3K／AKt／mTOR信号通路中重要的负向调节因子，参与自噬体形成与成熟的调控蛋白，在细胞增殖、新陈代谢、凋亡等活动中发挥重要的调控作用，Becbin1也是重要的KOA治疗靶点［26］。当Becbin1表达增加时，PI3K／AKt／mTOR信号通路被抑制，从而出现细胞自噬作用的水平增加，提高细胞应对损伤的能力，减少软骨细胞凋亡，从而改善患者关节退变病情，进而改善膝骨关节炎患者症状。研究表明，在骨关节炎自然退变病程的软骨细胞中，Beclin1的表达是减少的，mTOR的表达是增加的［28］。本研究中，治疗后，试验组自噬相关蛋白PI3K、pAkt、mTOR、Beclin-1表达与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明芍药甘草附子汤能通过增加Becbin1的表达，使PI3K／AKt／mTOR信号通路被抑制，从而增加软骨细胞的自噬水平，减少软骨细胞的凋亡，改善患者病情及疼痛症状。同时试验组血清及关节液中的IL-1和TNF-α在治疗后也明显降低，说明骨性关节炎的演变与机体的炎性因子大量分泌正相关，自噬水平的提高也可能降低患者炎性因子的释放，减少局部炎症反应，进而延缓患者关节软骨的退变进程。

综上可知，芍药甘草附子汤可显著缓解膝骨关节炎患者膝关节疼痛症状，改善关节活动度，激活关节软骨细胞的自噬调节作用，抑制细胞凋亡，延缓KOA软骨的退变进程。