斑蝥酸钠对人食管癌细胞作用的体外实验研究

王桂琦，熊朝晖，杜 萍，王 岩，杨光耀，马晓静

(1.河北省石家庄市第一医院外科，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第一医院麻醉科，河北 石家庄 050011)

斑蝥素为传统中药斑蝥的活性成分，临床上对多种肿瘤有效，且具有升高白细胞而无骨髓抑制特点[1]。斑蝥酸钠是斑蝥素的半合成药物，具有抗多种肿瘤作用，并且具有升高白细胞、增加机体免疫力等作用[2-3]。与斑蝥素相比，斑蝥酸钠的毒性、刺激性明显减小，尤其明显减低泌尿系统的不良反应。但目前文献对于其抗癌机制报道较少。本研究以人食管癌Eca109细胞系为对象，初步探讨斑蝥酸钠对食管癌细胞株生长的抑制作用及其机制，旨在为临床治疗食管癌提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与药物：RPMI 1640培养液、小牛血清,四甲基偶氮唑蓝(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及Rnase(美国Sigma公司),斑蝥酸钠注射液(贵州神奇制药有限公司)。

1.1.2 细胞与细胞培养：食管癌细胞株Eca109购自于中国医学科学院肿瘤研究所，以含10%小牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，置于37℃含5%的CO2孵箱中进行生长，待细胞铺满瓶壁70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶来消化贴壁细胞，选用对数生长期细胞用于实验。

1.1.3 细胞流式仪：美国Becton Dickinson公司产荧光激活分选仪(FACS-420型)由河北省肿瘤研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 斑蝥酸钠对Eca109细胞毒性剂量与时间效应实验：Eca109细胞处于对数增殖期时，调整细胞浓度5×108/L，细胞悬液接种在12孔细胞培养板中。每孔加1mL细胞悬液与3mL含10%小牛血清的RPMI 1640液，加斑蝥酸钠，使斑蝥酸钠终浓度分别为1、4、10、40mg/L，并设DSMO对照组，每组设3个复孔。37℃下5%CO2培养箱中培养，分别于12、24、36、48、72h取样。加入5mg/L MTT 溶液20μL，继续培养4h，吸弃孔内上清液，每孔加入 DMSO 150μL，振荡10min，使结晶充分溶解,用酶标分析仪(490nm波长)测定每孔光吸收值(OD 值)。肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100%。细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%。

1.2.2 斑蝥酸钠对Eca109细胞凋亡剂量与时间效应实验及细胞周期测定：斑蝥酸钠浓度、作用时间同上。收集斑蝥酸钠处理后的细胞，用不含Ca2+Mg2+的PBS洗，离心800r/min，5min，各2次，以注射器针筒取细胞沉淀并加上TB针头，推入4℃预冷的70%酒精使细胞均匀分散，细胞固定20h以上。然后将细胞离心，调整细胞浓度为1×109/L，取500μL，加PI 50μL(50mg/L碘化物,0.1%柠檬酸钠,0 1%氚X-100)在室温下避光染色30min。样品过400目网后用流式细胞仪测定，显示凋亡细胞散点图；细胞凋亡时在G1期左侧出现近2倍体细胞群峰。同时用流式细胞仪测定细胞G1期、S期及G2+M期细胞百分数变化。每个样品分析1×106个细胞×3平行孔。

2 结 果

2.1 斑蝥酸钠对Eca109细胞存活的影响：随着斑蝥酸钠作用时间的延长，对Eca109细胞表现出的细胞不良反应亦相应增加(P<0.05),随着药物浓度的增加Eca109细胞存活率出现降低(P<0.05)。说明斑蝥酸钠的作用对时间、浓度均有依赖性关系。见表1。

组别时间12h24h36h48h72h0mg/L组96.01±2.6594.65±4.3590.41±3.5464.30±4.8553.90±4.051mg/L组90.29±2.5185.59±3.0181.18±4.52 55.69±5.8145.07±6.444mg/L组86.60±1.3079.64±2.7072.80±3.62 48.46±3.0840.22±4.1810mg/L组81.17±2.9471.58±3.1366.54±5.3541.01±6.7035.20±4.4640mg/L组76.23±3.6062.60±4.9054.07±3.2739.36±5.6826.38±6.91

2.2 斑蝥酸钠对Eca109细胞凋亡的影响：Eca109细胞在1、4mg/L斑蝥酸钠作用后12h即可出现凋亡峰，24h达高峰；10、 40mg/L斑蝥酸钠在药物作用48h才出现明显的凋亡峰。斑蝥酸钠在10mg/L浓度时其诱导Eca109细胞凋亡的作用较其他浓度呈现明显时间依赖性关系。见表2。

2.3 斑蝥酸钠对Eca109细胞周期的影响：Eca109细胞经不同浓度斑蝥酸钠作用后处于G2+M期细胞比例均出现增加,呈现G2+M期阻滞现象(P<0.05)。以40mg/L斑蝥酸钠作用24、48h尤为明显。见表3。

组别时间12h24h48h0mg/L组8.36±2.368.25±1.957.12±2.241mg/L组26.21±2.5816.82±2.5114.32±3.304mg/L组35.34±2.3628.32±7.1022.06±2.0610mg/L组44.09±2.9061.28±6.4531.25±4.6540mg/L组51.27±3.2579.30±5.2635.41±3.97

3 讨 论

斑蝥酸钠是一种广谱抗癌药，在以往的报道中单药或联合化疗对食管癌等恶性肿瘤有一定疗效[4]，因放疗对于处于G2+M期肿瘤细胞杀灭作用最强，而斑蝥酸钠能将肿瘤细胞阻滞于G2+M期，故斑蝥酸钠联合放疗能起到“增敏”作用，提高放疗治疗中晚期肿瘤的疗效，并降低放疗反应。斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥体，我国首先发现其具有抗肿瘤的特性[5]。斑蝥主要药理成分是斑蝥素，随着近代药理学研究的进展，已提取、合成了一系列斑蝥酸钠、甲基斑蝥胺等衍生物，这些衍生物与斑蝥素相比毒性大大降低，而且抗癌作用更明显[6]。但是，从目前文献来看，斑蝥酸钠诱导食管癌细胞凋亡及其作用机制的报道不多[7]。本研究结果显示，斑蝥酸钠对Eca109细胞有较强的抑制作用，且存在时间和剂量效应关系，无论是低浓度还是高浓度斑蝥酸钠均可将Eca109细胞阻滞于G2+M期。1、4、10、40mg/L 4个浓度斑蝥酸钠12h均可检测到明显的G2+M期阻滞；24h时1、4mg/L 2个浓度的斑蝥酸钠G2+M期阻滞已消退，而10、40mg/L斑蝥酸钠G2+M期阻滞作用达高峰。上述结果提示低浓度的斑蝥酸钠处理的细胞阻断G2+M期短暂、不完全；而高浓度的斑蝥酸钠对Eca109细胞的G2+M期阻断作用比低浓度的作用完全且持久，并且随着浓度增高这种阻断作用越明显。在G2+M期阻断作用过去后，流式细胞仪可检测到凋亡峰，1、4mg/L斑蝥酸钠由于其过早越过G2+M期，12h即可检测到凋亡峰，24h达高峰；10、40mg/L斑蝥酸钠在药物作用后48h才有明显的凋亡峰，且10mg/L斑蝥酸钠诱导的凋亡较40mg/L为高。提示低浓度的斑蝥酸钠可能较高浓度的更易诱导细胞凋亡，高浓度斑蝥酸钠更容易导致细胞坏死。

斑蝥酸钠具体诱导细胞凋亡的机制尚不完全清楚；但目前对其类似物斑蝥素研究较多的是蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase-2A,PP2A)的抑制剂，同时也是蛋白磷酸酯酶1(protein phosphatase-1,PP1)的抑制剂[8]。如果PP1的功能被抑制，会使一种重要的周期蛋白Rb不能去磷酸化，细胞不能完成由M到G1期的正常转换，会出现M期阻滞等变化。而PP2A活性被抑制，会促使细胞越过G2进入M期“检查点”，使一些复制未完成或DNA受损的细胞也进入M期，导致异常的有丝分裂，最终使细胞发生凋亡[9]。由此我们推断，斑蝥酸钠诱导的Eca109细胞凋亡的作用可能与使细胞发生M期阻滞有关。

[1] LIU D,CHEN Z.The effects of cantharidin and cantharidin derivates on tumour cells[J].Anticancer Agents Med Chem,2009,9(4):392-396.

[2] LISSINA E,YOUNG B,URBANUS ML,et al.A systems biology approach reveals the role of a novel methyltransferase in response to chemical stress and lipid homeostasis[J].PLoS Genet,2011,7(10):e1002332.

[3] 李保庆，王桂琦.术前应用斑蝥酸钠诱导食管癌细胞凋亡的临床观察[J].中医杂志,2004,45(2):128-129.

[4] 蒋淑年，杨帆，马兆明.斑蝥酸钠配合三维适形放疗治疗食管癌近期疗效观察[J].齐齐哈尔医学院学报，2010,31(20):3258-3259.

[5] TSAUER W,LIN JG,LIN PY,et al.The effects of cantharidin analogues on xanthine oxidase[J].Anticancer Res，1997，17(3C):2095-2098.

[6] VERMA AK,PRASAD SB.Antitumor effect of blister beetles:an ethno-medicinal practice in Karbi community and its experimental evaluation against a murine malignant tumor model[J].J Ethnopharmacol，2013，148(3):869-879.

[7] HU YC,LAM KY,LAW S,et al.Identification of differentially expressed genes in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) by cDNA expression array overexpression of Fra-1,Neogenin,Id-1,and CDC25B genes in ESCC[J].Clin Cancer Res,2001,7(8):2213-2221.

[8] HUANG WW,KO SW,TSAI HY，et al.Cantharidin induces G2/M phase arrest and apoptosis in human colorectal cancer colo 205 cells through inhibition of CDK1 activity and caspase-dependent signaling pathways[J].Int J Oncol，2011,38(4):1067-1073.

[9] LI W,XIE L,CHEN Z,ZHU Y，et al.Cantharidin,a potent and selective PP2A inhibitor,induces an oxidative stress-independent growth inhibition of pancreatic cancer cells through G2/M cell-cycle arrest and apoptosis[J].Cancer Sci，2010,101(5):1226-1233.