糙皮侧耳对秸秆木质纤维素降解能力的研究*

龚 娜，陈 珣，刘国丽，肖 军

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁 沈阳 110161）

食用菌产业是我国的朝阳产业，在农产品产业中的地位日趋重要[1]。食用菌栽培的主要原料有棉籽壳、木屑，随着食用菌产业的不断扩大，传统原料供应紧张，价格持续上涨，不仅增加了生产成本，还造成了“菌林矛盾”。因此，亟需寻找新型替代基质，以降低阔叶木屑的大量消耗，有效地保护森林资源，缓解食用菌产业发展与林业资源的矛盾[1]。中国是农业生产大国，农作物秸秆资源储量巨大，秸秆中含有食用菌栽培原料最主要的碳源。在物质循环过程中，食用菌通过菌丝体分泌的水解酶及氧化酶降解和利用秸秆中的大分子物质，如木质素、纤维素、半纤维素、蛋白质、多糖等，通过食用菌菌丝的生长的利用子实体形成将其转化为优质、味美的蛋白质[2-4]。

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus） 分类上属于担子菌门 （Basidiomycota） 层菌纲 （Agaricomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 侧耳科 （Pleurotaceae） 侧耳属（Pleurotus），是现在全球栽培面积和消费量最大的食用菌之一[5]，其适应性广，多种农作物秸秆均可作为栽培基质[6]。玉米秸秆资源丰富，可替代木屑、棉籽壳，且价格便宜，可作为栽培糙皮侧耳的主要原料[7-8]，既能减少对林业资源的破坏，又能为实现农作物秸秆的就地转化和综合利用提供有效途径。

为了更好地了解各糙皮侧耳菌株对玉米秸秆的利用能力，筛选获得高效利用纤维素、半纤维和木质素的菌株是解决玉米秸秆降解利用问题的关键。对不同糙皮侧耳菌株降解利用纤维素、半纤维素和木质素的能力进行初步探究，快速筛选适合秸秆栽培的优势糙皮侧耳菌株。为推广玉米秸秆应用于食用菌栽培提供一定的研究依据，这对未来食用菌生物转化农业废弃物的研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

18个糙皮侧耳菌株由辽宁省农业科学院食用菌研究所试验室引种并保存，菌种信息见表1。

表1 糙皮侧耳供试菌株Tab.1 Tested strains of the Pleurotus ostreatus

1.1.2 培养基

PDA培养基：葡萄糖20 g·L-1、马铃薯200 g·L-1、琼脂粉 15 g·L-1，去离子水 1 000 mL。

液体种子培养基：葡萄糖20 g·L-1、马铃薯200 g·L-1，去离子水 1 000 mL。

羧甲基纤维素钠培养基（CMC-Na培养基）[9]：羧甲基纤维素钠 2.0 g·L-1、蛋白胨 2.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.88 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、琼脂粉15 g·L-1，去离子水 1 000 mL，pH 7.0。

木聚糖培养基：木聚糖 10.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、蛋白胨 1.0 g·L-1、硫酸铵 4.0 g·L-1、琼脂粉 15 g·L-1，去离子水 1 000 mL。

PDA-Bavendamm显色反应培养基[10]：在1 000 mL PDA培养基中加入0.14 mmol·L-1鞣酸。

木质素降解培养基[11]：木质磺酸钠20.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 菌种制备

将供试的糙皮侧耳菌株接入PDA培养基及液体种子培养基中进行菌株活化，每个菌种接种3支，待菌丝活性恢复后备用。

1.2.2 降解利用纤维素菌株的筛选

采用直径0.5 cm×0.5 cm的打孔器对已经活化好的菌种平板进行打孔后，用无菌镊子将菌饼接入直径为9 cm的羧甲基纤维素钠培养基平板中央，置于25℃条件的生化培养箱中避光培养。当菌落直径长到培养皿直径的2/3时，采用刚果红溶液进行染色，30 min后清除染液，然后采用NaCl溶液进行脱色，再用清水冲洗培养基。采用游标卡尺以“十字划线法”量取菌落直径以及水解圈直径大小，通过比较水解圈直径与菌落直径大小的比值及水解圈大小、清晰程度，确定初筛菌株[12]，每组设置 3个重复。酶指数（EI）的计算公式为：

式中：D为水解圈直径（mm）；d为菌落直径（mm）。

1.2.3 降解利用半纤维素菌株的筛选

半纤维素主要成分为五碳和六碳的单糖构成的异质多聚体，其中木聚糖是最主要的成分[12]。故主要通过比较各菌株菌丝在木聚糖上生长情况来评价各糙皮侧耳菌株对木聚糖的利用能力。采用直径为0.5 cm的打孔器对已经活化好的菌种平板进行打孔，然后将菌饼接入到木聚糖培养基平板中央，25℃恒温培养箱中黑暗培养。每日观察菌丝生长情况，培养8 d后以“十字划线法”量取菌落直径，比较各菌株菌丝的生长情况。每组设置3个重复。

1.2.4 降解利用木质素菌株的筛选

1）木质素利用测定

采用直径为0.5 cm的打孔器对已经活化好的各菌种平板进行打孔，接种于PDA-Bavendamm培养基的平板中央，25℃恒温培养箱中黑暗培养。观察并记录菌落周围是否有棕褐色变色圈产生，有棕褐色变色圈者记为“+”，记录显色的时间以及变色的程度，“+”“++”“+++”“++++”表示显色反应逐渐加强。

2） 木质素降解率的测定

首先配制浓度为 0、0.025 g·L-1、0.050 g·L-1、0.075 g·L-1、0.100 g·L-1、0.150 g·L-1、0.200 g·L-1的木质素磺酸钠溶液，并测定各浓度溶液在280 nm波长下吸光度值，绘制标准曲线[13]。

将活化好的不同菌株种子液按2%接种量接种至木质素降解培养基中，置于25℃下恒温摇床中避光培养9 d，设置转速为120 r·min-1。待培养结束后，将发酵液10 000 r·min-1离心10 min后取上清液，经稀释后测定OD280值，根据线性回归方程计算上清液中木质素磺酸钠含量[14]。木质素降解率（P1，%）计算公式为：

式中：C为发酵后木质素磺酸钠的含量（g·L-1）。

1.2.5 数据分析

采用SPSS软件检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同糙皮侧耳对纤维素利用潜力的定性分析

不同糙皮侧耳菌株在羧甲基纤维素钠培养基中的生长情况见表2。

由表2可知，通过比较不同糙皮侧耳菌株在羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基上的生长情况，评价不同菌株对纤维素利用能力。试验表明，不同菌株菌丝生长及产生透明圈的情况存在明显的差异，说明不同糙皮侧耳菌株均具有一定的纤维素酶活性。在菌丝平均生长速率方面，菌株P8、P4、P5、P6具有较好的表现且其水解圈直径也较大。酶指数方面，菌株P10和P8表现最好。菌株P10虽然平均生长速率和透明圈生成情况并不最突出，但酶指数最高，说明菌株P10纤维素利用能力高于其他菌株，降解纤维素的能力最强。

表2 不同糙皮侧耳菌株在羧甲基纤维素钠培养基中的生长状态Tab.2 The growth of different Pleurotus ostreatus strains of CMC-Na media

2.2 不同糙皮侧耳对半纤维素利用潜力的定性分析

不同糙皮侧耳菌株在木聚糖中的生长情况见表3。

由表3可知，各菌株在木聚糖培养基上的菌丝直径存在明显的差异，菌丝生长速率差异显著。其中，菌株P16、菌株P3、菌株P14和菌株P4菌丝生长速度相对较慢。菌株P10、菌株P8的生长速度最快，分别为0.99 cm·d-1和0.97 cm·d-1。说明在半纤维素利用方面，菌株P10和菌株P8的利用能力较强。

2.3 不同糙皮侧耳菌株对木质素降解的能力

2.3.1 不同糙皮侧耳对木质素利用潜力的定性分析

利用PDA-Bavendamm培养基对不同糙皮侧耳菌株降解木质素能力进行初步筛选，供试不同糙皮侧耳菌株在PDA-Bavendamm培养基中显色反应的试验结果见表4。

表4 不同糙皮侧耳菌株在PDA-Bavendamm中的生长情况Tab.4 Growth condition of different Pleurotus ostreatus strains in the PDA-Bavendamm

由表4可知，供试菌株在PDA-Bavendamm培养基中的显色反应均呈阳性，表示各菌株具有降解木质素的能力，不同菌株在PDA-Bavendamm平板上显色反应不同。根据变色圈产生的颜色深浅判断，所有供试菌株均能降解木质素，菌株P10、P4降解木质素能力最强，菌株P15降解能力较强，菌株P3、P11降解木质素能力最弱。菌株P10菌落直径和变色圈直径均大于其他菌株，说明菌株P10更能快速降解并利用木质素。通过木质素降解能力的比较，从中筛选出降解能力最强的菌株为P10。

2.3.2 不同糙皮侧耳菌株的木质素降解率

经过计算，得到木质素磺酸钠浓度与OD280间的线性回归方程为：

此线性回归方程的相关系数R2为0.998。18种不同糙皮侧耳菌株木质素降解率统计见图1。

图1 不同糙皮侧耳菌株木质素降解率Fig.1 Lignin degradation rates of different Pleurotus ostreatus strains

由图1可知，各菌株对木质素磺酸钠降解程度存在显著差异，其中P10菌株木质素降解率最高，达到47.13%，降解效果最好。

3 结论与讨论

秸秆主要组分包括纤维素、半纤维素和木质素。降解木质纤维素能有效提高农业废弃物的利用，筛选纤维素和木质素降解能力强的菌株是解决秸秆生物降解问题的关键[15]。自然界中，许多微生物能产生相应的酶类降解木质素纤维素，食用菌生长发育过程中碳源的主要来源就是木质纤维素，具有极强木质纤维结构降解能力和特殊代谢类型的白腐真菌，被认为是主要的木质素降解微生物[16-17]。白腐菌在碳循环中处于核心地位，是目前为止已知的唯一一类可以将木质素彻底降解成H2O和CO2的真菌。依据此降解方式，糙皮侧耳被划分到白腐菌中[18]。筛选获得具有高效纤维素降解能力的菌株是高效利用纤维素类物质的关键，而评价菌株降解纤维素能力的重要指标主要依据纤维素酶活力[19]。优势糙皮侧耳菌株是产业发展的基础，能极大的提升栽培效益。

多年的食用菌生物降解秸秆的研究表明，不同菌株的降解能力相差较大，侧耳类降解木质素纤维素功能较强，在食用菌生物降解秸秆体系中，糙皮侧耳可以说是该体系研究中的模式菌种。试验初步研究了糙皮侧耳菌株对玉米秸秆利用能力，对各菌株对纤维素、半纤维素和木质素的利用能力进行初步的筛选，明晰不同糙皮侧耳对纤维素、半纤维素和木质素的利用能力，供试菌株通过木质素降解率试验，确定了降解秸秆能力最强的菌株。试验研究结果表明，综合各菌株对纤维素、半纤维素和木质素的利用情况研究，P10菌株的能力最强，降解纤维素的能力中酶指数最高，为0.97，说明P10菌株纤维素利用能力高于其他菌株，木聚糖培养基上的菌丝直径菌株P10的生长速度最快，为0.99 cm·d-1，说明P10菌株半纤维素利用能力高于其他菌株，在木质素的实验中降解率达到47.13%，降解效果最好。