大球盖菇液体菌种培养基的优化*

刘克芳，于国荣，王华丽，程显好，盖宇鹏，李维焕**

（1.鲁东大学农学院山东省食用菌技术重点实验室，山东 烟台 264025；2.山东药品食品职业学院，山东 威海 264210）

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata） 别称酒红球盖菇、皱环球盖菇、赤松茸，属担子菌门（Basidomycota） 层菌纲 （Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 球盖菇属 （Stropharia）[1]，是联合国粮农组织向发展中国家推荐栽培的食用菌品种之一[2]。其色泽艳丽，美味爽口[3]，营养丰富，具有“素中之荤”的美称，很受消费者喜爱。

大球盖菇具有很高的食用价值与药用价值，子实体中含有丰富的蛋白质、多糖、甾醇、黄酮等营养成分[4]。研究发现，每100克大球盖菇子实体中粗蛋白含量为29.1 g，富含人体必需的8种氨基酸[5]。据报道，大球盖菇多糖可以有效预防冠心病，还可以助消化、软化血管，缓解精神疲劳，增强免疫力，而且对小白鼠S180肉瘤及艾氏腹水癌的抑制率均达70%以上[6]，逐步用于抗癌药物筛选。随着经济的发展及生活水平的提高，消费者越来越重视食品健康问题。大球盖菇是高蛋白，高钙钾镁、低脂肪的绿色健康食品[7]，且栽培成本低，产量高，具有广阔的发展前景[8]。

液体菌种是指采用液体培养基生产的菌丝体纯培养物，菌丝体在培养基中呈絮状或球状[9]。相对于固体菌种，食用菌液体菌种生产技术具有周期短、产量高、接种方便、菌种用量少等优点[10]，可显著提高生物转化率和生产效率，降低生产成本，十分适合作为配套技术用于食用菌的工厂化生产[11]。当前，越来越多的专家、学者参与液体菌种和培养等相关研究[12]。

目前大球盖菇的栽培仍沿用传统的固体菌种接种方法，采用常规PDA培养基，菌丝不仅长速慢，而且生长状态差，菌丝细弱[13]。制备原种或栽培种时，一般需要2个～3个月甚至更长时间才能完成菌丝萌发，极大地限制了大球盖菇的生产。目前对大球盖菇液体培养的研究少见报道[9]。

不同培养料配方对大球盖菇菌丝生长有重要影响，通过探讨稻壳浸出液、玉米面、黄豆面等不同组分对大球盖菇液体菌丝生长的影响，对大球盖菇液体培养基进行优化，旨在获得能够降低生产成本、缩短生长周期、提高菌种质量的液体培养基配方，为工业化生产大球盖菇液体菌种提供经济、适用、高效的培养基配方。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

大球盖菇菌种由鲁东大学农学院山东省食用菌技术重点实验室提供。

PDA固体培养基[14]：马铃薯（煮汁） 200 g、葡萄糖20 g、酵母浸膏3 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁1 g、琼脂15 g，加水定容至1 L。121℃灭菌20 min。

设计母种液体培养基配方见表1。

表1 液体培养基配方Tab.1 The liquid components of mother culture

由表1所示，通过多种配方组合，以期从中筛选出优良液体培养基配方。以1 L液体培养基为例，称量100 g或200 g的稻壳，提前1 d用纯水浸水过夜，取稻壳浸出液。称取去皮马铃薯200 g切成小丁或者条状放入不锈钢锅或铝锅中，加稻壳浸出液1 000 mL。煮沸15 min～20 min至马铃薯熟而不烂，用4层～6层纱布过滤，取滤液，补纯水至1 L，加热至沸。依次加入葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁1 g、酵母浸膏3 g以及占稻壳干料总重量10%～20%的玉米面或黄豆面。定容液体培养基为1 L，121℃灭菌 20 min。

麦粒培养基[15]：新鲜麦粒筛选干净，浸泡24 h～48 h，放入锅中煮至无硬心，捞出冷却拌入麦粒干重0.1%的碳酸钙，装瓶，121℃灭菌2.5 h～3.0 h，出锅冷却至20℃。

1.2 仪器与设备

HZQ-Q全温振荡器，中国良友仪器；HPS-400生化培养箱，中国精达仪器制造有限公司；OHAUS分析天平，美国奥豪斯公司；超净工作台，中国亚泰科隆仪器技术有限公司；LZDX-50KB立式压力蒸气灭菌锅，德国Systec公司；游标卡尺，中国雪锋量具有限公司；AWL-1002-U艾科浦超纯水系统，中国科瑞环保设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母种活化

将供试菌种转接到PDA斜面培养基，于25℃培养至满管，备用[16]。

1.3.2 液体菌种制备及发酵

用直径为5 mm的无菌打孔器取4块生长最旺盛的平板菌落边缘菌丝块[17]。无菌条件下接入500 mL三角瓶中，瓶中装液量为200 mL，液体菌种培养基按表1分别设置对照组（配方1） 和试验组，每个配方接种5瓶。将三角瓶置于恒温振荡培养箱中 150 r·min-1、23℃、避光发酵培养[9]，每隔 24 h称量液体发酵摇瓶质量，观察菌丝球形状。

培养8 d后，取10 mL培养液，倒入培养皿中，用游标卡尺测量10个菌丝球直径，取平均值。测量完成后，将培养液用二层纱布过滤，把水挤压干，用1/100电子天平（精度0.01 g）称重菌丝球湿重，最后计算每100毫升培养液中菌丝球湿重。培养8 d后，将菌液过滤，菌丝体用蒸馏水充分洗涤，置于80℃干燥箱中烘干至恒重，用电子天平称重测量菌丝球干重。

1.3.3 原种制备及培养

用移液枪取培养8 d的液体培养基菌液10 mL，接种于麦粒培养基（麦粒99.9%、碳酸钙0.1%）中，每个配方接种5瓶。将原种置于培养室中，24℃～28℃黑暗条件下培养。

每天观察玻璃瓶中菌丝颜色、菌丝长势；每隔72 h测量菌丝长度，计算菌丝生长速度及平均满瓶时间。

2 结果与分析

2.1 液体菌种生长情况

各配方培养8 d后，液体培养基大球盖菇菌丝球生长情况见图1及表2。

表2 液体菌种生长情况Tab.2 The measurement results of liquid spawn

由图1可知，培养基配方对大球盖菇液体菌丝球的生长状态影响很大。配方4～配方9培养基所得菌丝球大小均匀且表面光滑；而配方1～配方3培养基所得菌丝球大小不均且表面有刺状突起。配方1～配方3菌球直径大小不一；配方4～配方9培养基所得菌丝球直径明显小于配方1～配方3的菌丝球；而配方5菌丝球平均直径最小。

图1 各配方菌丝球生长情况Fig.1 Growth of mycelium pellets in each formula

配方5、配方6、配方9菌丝球湿重较高，均大于15.00 g·100-1mL-1；配方5菌丝球湿重最大，为18.47 g·100-1mL-1；配方4、配方8菌丝球湿重较大，为10.00 g·100-1mL-1以上；而配方2、配方3、配方8菌丝球湿重较小，均小于7.00 g·100-1mL-1；配方2菌球湿重最小，为5.13 g·100-1mL-1。

配方4、配方5、配方6菌丝球干重较高，均大于1.50 g·100-1mL-1；配方5菌丝球干重最重，为2.01 g·100-1mL-1；配方2菌丝球干重最小，为0.33 g·100-1mL-1。

2.2 原种生长情况

在所有供试培养基上，大球盖菇菌丝均呈灰白色或纯白色，但其他生长状况不同。不同配方原种大球盖菇生长情况统计见表3。

由表3可知，配方3、配方5、配方7原种满瓶时间较短，均不超过20 d，其中配方3所需时间最短，为16 d；配方1、配方4、配方6、配方8、配方9原种满瓶时间较长，配方1满瓶时间最长为27 d。

表3 原种生长情况Tab.3 The growth situation of mother spawn

配方4、配方5、配方7、配方8、配方9原种长势最好，菌丝极浓密；菌丝平均生长速度均大于3 mm·d-1，配方 8生长速度最快，为 3.93 mm·d-1。配方1、配方2、配方6、配方9所得原种生长速度较快，菌丝生长速度均大于2 mm·d-1。配方3原种长势较好，菌丝浓密；而配方1、配方2、配方6培养基所得原种长势最弱，菌丝稀疏；配方2生长速度最慢，为1.33 mm·d-1。

根据满瓶时间，菌丝长势和生长速度，最终筛选出了2种较优培养基，即配方5、配方7，其满瓶时间短，菌丝纯白、浓密，生长速度较快。

3 讨论与结论

从菌丝球直径的角度分析，添加200 g稻壳浸出液的培养基（配方3）菌丝球密度比添加100 g稻壳浸出液培养基（配方1）菌丝球直径更小，说明在一定浓度范围内，稻壳浸出液浓度越大，菌丝球直径越小；添加不同浓度梯度的玉米面或黄豆面等固体不溶物的培养基（配方4～配方9） 比未添加固体不溶物的培养基（配方1～配方3） 菌丝球直径更小，说明添加固体不溶物有助于减小菌丝球直径，原因是在菌丝摇床培养过程中，固体不溶物吸附菌丝片段，导致菌丝球直径变小，菌球直径大小差异较小，密度更大，更有利于生产。针对一般市面价格，玉米面比黄豆面成本更低，因此结合成本考量，配方5为优选培养基配方。

从菌丝球湿重和干重的角度分析，添加200 g稻壳浸出液的培养基（配方3）菌丝球干湿重比添加100 g稻壳浸出液培养基（配方2）菌丝球干湿重更大，说明在一定浓度范围内，稻壳浸出液浓度越大，菌丝球干湿和湿重越大；添加不同浓度梯度的玉米面或黄豆面等固体不溶物的培养基（配方4～配方9）比未添加固体不溶物的培养基（配方1～配方3）平均干湿重更大，说明添加固体不溶物有助于增大菌丝球生物量，更有利于生产。在添加200 g稻壳浸出液的基础上，添加玉米面的培养基（配方5）比添加黄豆面的培养基（配方7、配方9）平均菌丝球干湿和湿重更大，说明玉米面更有利于增大菌丝球生物量；结合成本考量，配方5为优选培养基配方。

从菌丝长势的角度分析，添加200 g稻壳浸出液的培养基（配方3） 长势优于PDA液体培养基（配方1） 及添加100 g稻壳浸出液培养基（配方2），说明在一定浓度范围内，稻壳浸出液浓度越大，菌丝长势越好；添加不同浓度梯度的玉米面或黄豆面等固体不溶物的培养基（配方4～配方9） 比未添加固体不溶物的培养基（配方1～配方3）长势明显更好，说明添加固体不溶物有助于菌丝长势，更有利于生产。

从满瓶时间和菌丝生长速度的角度分析，添加200 g稻壳浸出液的培养基（配方3）满瓶时间及生长速度均优于PDA液体培养基（配方1） 及添加100 g稻壳浸出液培养基（配方2）。说明在一定浓度范围内，稻壳浸出液浓度越大，菌丝生长速度越快，所需生长周期越短，大大缩短生长周期，有利于实际生产。在添加200 g稻壳浸出液的基础上，添加黄豆面的培养基（配方7、配方9）比添加玉米面的培养基（配方5）平均满瓶时间及菌丝球生长速度更优。但试验显示，添加玉米面的培养基（配方5）生长速度更均匀，菌丝长势更整齐，添加20 g玉米面的培养基（配方5）比添加10 g玉米面的培养基（配方4）满瓶时间更优，说明在一定浓度范围内，玉米面浓度越大，越有利于促进菌丝生长。

樊玉萍等[20]在研究平菇液体菌种配方时，用玉米粉部分代替了麸皮，也得出了加入玉米粉会使菌丝球大小均匀、干重大的结论。查磊等[21]在进行双孢菇液体培养基优化时也发现，利用玉米粉和黄豆粉来替代麸皮作为氮源，得到的菌丝球外观、形态更好。

本研究在前人的基础上，优化了玉米面和黄豆面的添加量，并进一步加入了稻壳浸出液，最终筛选出配方5：200 g稻壳浸出液、马铃薯200 g、葡萄糖20 g、酵母浸膏3 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁1 g、玉米面20 g，加水定容至1 L为最佳配方。