CBX3通过STAT3信号通路调控乳腺癌细胞增殖、迁移

徐 彬 杨清峰 汪 洋 刘 萍 张发苏

乳腺癌发病率和死亡率居女性恶性肿瘤之首，对女性的健康和生命构成严重威胁。随着早期检测技术的改善和乳腺癌治疗的进步，乳腺癌患者的生存期越来越长。五年存活率从1976年的75%上升到2017年的91%。尽管乳腺癌的诊断和治疗（包括根治性手术和辅助治疗）取得了进展，但由于侵袭性的临床生物学行为，导致晚期生存率仍然很低。因此，寻找新的治疗乳腺癌的靶点是非常重要的。

染色体盒蛋白同源物3（chromobox 3，CBX3）属于异染色质蛋白1（Heterochromatin Protein 1，HP1）家族，参与转录激活或抑制、细胞分化和生长、表观遗传修饰。最近的一些研究已经确定了CBX3在不同类型的人类癌症中的表达和作用。CBX3在人结直肠癌中表达增加，促进了肿瘤细胞的体内外增殖，这与其对结直肠癌细胞中CDKN1A的调控有关。Liang Y K等通过CCLE、ONCOMINE、Xena公共数据中心和Kaplan-Meier plotter等一系列数据库的分析，报道了CBX家族成员对乳腺癌患者的预后价值。结果发现，CBX家族成员的mRNA表达在乳腺癌组明显高于正常对照组。生存分析显示，CBX3 mRNA高表达与所有乳腺癌患者的无复发生存（RFS）恶化相关。说明在乳腺癌发生发展中发挥重要作用，而其可能涉及到的下游机制，有待进一步研究。本研究旨在探讨CBX3在乳腺癌组织中的表达，及其对乳腺癌细胞增殖、迁移的影响，并初步研究其下游作用机制，以期为乳腺癌治疗提供新的思路。本研究首次探讨CBX3在乳腺癌中的功能作用和预后价值。利用基因高表达和沉默技术检测CBX3是否可以通过调控STAT3的表达发挥对乳腺癌细胞增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 数据库分析 本研究通过TCGA官方数据库下载1222例非配对乳腺癌及癌旁组织、112例（年龄41～71岁，全部为女性、安徽省妇幼保健院乳腺科乳腺癌患者）配对乳腺癌及癌旁组织中患者的基因表达数据。利用perl软件和R语言软件整合乳腺癌表达谱数据，分析CBX3基因在乳腺癌组织和配对癌旁组织中的表达情况。

1.2 试剂与仪器 正常人乳腺上皮细胞株MCF-10A，乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自广州赛库生物科技有限公司，乳腺癌细胞株MCF-7、SKBr3来自医学遗传中心实验室；DMEM培养基购于美国Hyclone公司；Trizol试剂、ECL显色液、脂质体 Lipofectamine TM2000转染试剂购于美国Invitrogen公司；CBX3过表达质粒及siRNA由上海吉玛公司设计合成；MTT试剂购于美国 Sigma公司；Transwell小室购于碧云天生物技术有限公司；GAPDH、CBX3、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Jak2、p-Jak2、STAT3、p-STAT3一 抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠二抗均购于Abbkine科技有限公司。

1.3 细胞培养 正常人乳腺上皮细胞MCF-10A，培养于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7、SKBr3分别培养于含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，5% CO、37 ℃条件培养箱中传代培养，以进行后续实验。

1.4 细胞转染及分组 取对数生长期细胞，于转染前24 h将细胞以30×10个/孔接种于6孔板；转染时按照脂质体Lipofectamine TM2000转染试剂说明书，MCF-7细胞分别转染高表达质粒，记作CBX3、NC（细胞转染阴性对照组）、空白对照组（未转染的MCF-7细胞）；siRNA记作si-CBX3、si-NC、空白对照组（未转染的MCF-7细胞），转染时加入相应试剂并混合均匀，将细胞培养基换为无血清培养基，5% CO、37 ℃条件培养箱培养6 h后更换新鲜培养基，然后进行后续实验。实验分组：Control组（未转染的空白对照组）、NC组、CBX3组；Control组（未转染的空白对照组）、si-NC组（细胞转染阴性对照NC）、si-CBX3组。

1.5 Western Blot检测 转染48 h的细胞加入预冷的RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；加入蛋白上样缓冲液，调整蛋白为相同浓度，95 ℃煮沸5 min使蛋白变性；10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，分离后的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶封闭2 h；一抗（CBX3、GAPDH、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3）按1:1000稀释，4 ℃摇床孵育过夜，二抗1:5000稀释，摇床孵育2 h；ECL发光试剂，暗室曝光拍照，以Image J软件分析目的蛋白，GAPDH为内参计算蛋白的灰度值，以其比值为蛋白的相对表达水平。

1.6 MTT法检测 待检测细胞用胰蛋白酶消化，以5×10个/mL细胞悬液，每孔200 μL，加入96孔板中，DMEM培养基培养，细胞贴壁后，分别以24、48、72 h加入MTT溶液20 μL混匀，继续孵育4 h；每孔加 DMSO 150 μL，培养30 min；酶标仪检测490 nm处的吸光值（OD值），计算细胞增殖抑制率，抑制率=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.7 克隆形成实验 转染24 h后收集细胞，进行细胞计数后，将500个细胞接种于6孔板内，在5%CO、37 ℃条件培养箱培养2周后，弃去培养基，加入4%多聚甲醛，室温固定20 min，结晶紫染色10 min后，拍照。

1.8 Transwell实 验 细 胞 以2×10个/mL加 入Transwell小室，上室加入新鲜无血清DMEM培养基100 μL，下室加入含有10% FBS的DMEM培养基600 μL，培养48 h后下室用多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min；显微镜下观察，随机选取5个高倍视野，计算迁移细胞数。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据分析，GraphPadPrism进行图片的制作。两组间数据比较采用

t

检验，多组间比较采用单因素方差分析。

P

＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TCGA数据库分析CBX3在乳腺癌组织的表达水平 TCGA数据分析显示，在非配对样本中，CBX3在乳腺癌组织的蛋白表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（见图1，

P

＜0.001）。而在配对样本中，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中CBX3的蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义（

P

＜0.001）。见图1。

图1 TCGA数据库分析CBX3在与乳腺癌组织与癌旁组织中的表达水平

2.2 CBX3在乳腺癌细胞中的表达 Western Blo检测结果显示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比较，乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBr3、MCF-7中，CBX3蛋白表达水平均升高（见图2，

P

＜0.001），选择表达水平最高的MCF-7细胞进行后续实验。

图2 CBX3在正常人乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中的表达

2.3 CBX3基因高表达和沉默后的表达水平分析 Western Blot检测显示，与Control、si-NC组比较，si-CBX3组MCF-7细胞中CBX3的蛋白表达水平显著降低（

P

＜0.05）。见图3A。与Control、NC组比较，CBX3组MCF-7细胞中CBX3蛋白表达水平显著升高（

P

＜0.05）。见图3B。

图3 转染过高表达质粒及siRNA 48 h后MCF-7细胞中CBX3的表达

2.4 CBX3基因对乳腺癌细胞增殖的影响 克隆形成实验检测显示，转染si-CBX3后的MCF-7细胞形成的细胞集落数目少于对照组（

P

＜0.05）。见图4A；MTT检测显示，与si-NC组比较，si-CBX3组乳腺癌细胞株MCF-7细胞24、48、72h增殖抑制率显著升高（

P

＜0.05）。见图4B。同样的，过表达CBX3后，CBX3组MCF-7细胞形成的细胞集落数目明显多于对照组（

P

＜0.05）。见图4C；MTT检测显示，与NC组比较，CBX3组MCF-7细胞24、48、72 h增殖抑制率显著下降（

P

＜0.05）。见图4D。

图4 CBX3基因对乳腺癌细胞增殖的影响

2.5 CBX3基因对乳腺癌细胞迁移的影响 Transwell实验显示，与si-NC组比较，si-CBX3组乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移细胞数目显著降低（

P

＜0.05）。见图5A；高表达CBX3后，与NC组比较，CBX3组MCF-7细胞的迁移细胞数目显著增高（

P

＜0.05）。见图5B。

图5 CBX3对细胞迁移能力的影响

2.6 CBX3基因对上皮细胞-间质细胞转化（EMT）的影响 Western Blot检测结果显示，与si-NC组比较，si-CBX3组MCF-7细胞中E-cadherin蛋白表达水平显著升高，而N- cadherin、Vimentin蛋白表达水平下降明显（

P

＜0.05）。见图6A。过表达CBX3后，与NC组相比，CBX3组MCF-7细胞中E-cadherin蛋白水平显著下降，而N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平明显升高（

P

＜0.05）。见图6B。

图6 CBX3对上皮间质转化的影响

2.7 CBX3基因对STAT3信号通路的影响 Western Blot检测显示，与si-NC组比较，si-CBX3组MCF-7细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平显著降低（

P

＜0.05）。见图7A。过表达CBX3后，与NC组相比，CBX3组MCF-7细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平显著升高（

P

＜0.05）。见图7B。

图7 CBX3对STAT3信号通路的影响

3 讨 论

随着癌症发病率的增加，人类从未停止探索癌症的有效治疗方法和预后生物标志物。CBX3属于HP1家族，也被称为染色质结合蛋白，包含一个N端染色质结构域和一个C端染色质阴影结构域。HP1蛋白通过直接与甲基化H3K9（组蛋白H3在赖氨酸9处带甲基）的启动子区结合，调控异染色质、基因表达和发育过程。一般来说，CBX3编码的异染色质蛋白1γ（HP1γ）是HP1的相似物，在多种癌症中发挥多种生物学功能，并与预后相关。

目前一些研究发现，HP1的CBX 2/3/4/7/8基因表达物、可促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭；在宫颈癌的发生发展中发挥癌基因的作用；可活化宫颈癌细胞JAK/STAT3信号通路，上调Bcl-2、STAT3、p21、p-STAT3（ser727）蛋白的表达，促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭。JAK/STAT3信号通路抑制剂AG490可显著下调CBX表达、减少宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭。已有研究报道，CBX3的异常表达与各种癌症的预后密切相关。进一步的实验也证实了CBX3能够抑制多种癌细胞系的发展。因此，它是一个潜在的癌症治疗靶点。Chang S C等的研究发现CBX3在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达 。因此，我们推测CBX3的高表达是NSCLC患者预后不良的一个预测因素。在细胞周期方面，CBX3在舌鳞状细胞癌中被证实可促进G1/S细胞周期的转变。CBX3不仅在恶性肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用，而且成为肿瘤患者可靠的预后指标和潜在的靶向治疗位点。然而，CBX3在乳腺癌的预后和进展中的作用尚未得到充分的证实。

通过对人乳腺癌组织及细胞中CBX3基因表达的检测，我们发现CBX3在乳腺癌组织及细胞中的表达水平显著升高。我们进一步通过转染的方法，高表达及下调CBX3基因在体外的表达水平，来探究CBX3基因对乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移是否有影响。结果表明，沉默CBX3表达后，si-CBX3组MCF-7细胞中CBX3的蛋白水平显著降低；细胞增殖抑制率显著升高。相反地，高表达CBX3表达后，MCF-7细胞中CBX3的蛋白水平显著升高。细胞增殖抑制率明显下降。提示CBX3的表达与乳腺癌细胞的增殖具有现状相关性。Chen L Y等的研究发现CBX3过表达诱导了胰腺癌细胞的迁移和侵袭，并导致了小鼠原位胰腺癌肿瘤的体内生长。与该研究结果一致的是，沉默CBX3表达后，细胞迁移抑制率显著升高，Vimentin、N-cadherin水平显著下降，E-cadherin水平明显升高；高表达CBX3后，细胞迁移率显著升高，Vimentin、N-cadherin水平升高，E-cadherin水平明显下降，提示体外抑制CBX3的表达，乳腺癌细胞的迁移能力受到抑制。

目前已经发现，JAK2/STAT3信号通路在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用。据报道，JAK2/STAT3信号参与调节膀胱癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、食管鳞癌细胞的迁移、侵袭和转移。基本转录因子3主要通过刺激JAK2/STAT3信号通路来加速胃癌发展。LncRNA HOST2下调可通过弱化JAK2和STAT3的磷酸化水平来抑制细胞迁移和侵袭。这些数据指出了JAK2/STAT3信号通路的激活在癌症进展过程中的重要作用。同样，在我们的研究中，CBX3敲低导致JAK2/STAT3通路失活，从而减缓乳腺癌的进展；CBX3过表达激活JAK2/STAT3通路，从而促进乳腺癌的进展。

综上所述，我们的研究结果表明，CBX3在人类乳腺癌的预后和进展中具有重要意义。CBX3在人乳腺癌组织和细胞中高表达。此外，应用JAK/STAT3信号通路抑制剂AG490等下调CBX3的表达，可通过抑制STAT3信号通路、抑制乳腺癌的肿瘤发生、侵袭、迁移。因此，CBX3可以作为乳腺癌患者潜在的独立预后生物标志物。