大蒜素对SD大鼠深Ⅱ度烫伤创面治疗作用及机制

陈 强， 梁哲勇， 屈航英， 钟 亮， 郜 扬， 郝军军， 马 涛， 韩 丹

西安交通大学第一附属医院 心血管外科，陕西 西安 710061

大蒜为百合科植物，其鳞茎用于防治疾病已有悠久历史[1]。近年来，有关大蒜的化学药理研究得到了广泛的重视，并且取得了突破性的进展[1-2]。大蒜素化学名为二烯丙基三硫化物，分子式为C6H10S3，相对分子量为178.3，是大蒜内的蒜氨酸在蒜酶的作用下酶解形成的活性成分[3]。多项研究表明，大蒜素具有抗氧化、抗病原微生物、抗炎、清除自由基、抗肿瘤细胞增生、调控细胞凋亡、降低胆固醇、抗血栓形成等作用[4-6]。深Ⅱ度烫伤是临床上较为常见的一种烫伤类型，累及真皮乳头层以下，但仍残留部分网状层，深浅不一，易发生严重的炎症反应，且易合并感染。有研究证实，烧烫伤导致皮肤发生炎症及代谢异常的机制与内质网应激有关[7]。本研究采用SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型探讨大蒜素治疗深Ⅱ度烫伤创面的作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠50只，体质量(250±10)g，成年雄性，提供机构为西安交通大学医学院实验动物中心。取材前，所有大鼠饲养1周，正常饮食，自由饮水，环境12：12光暗循环，温度18～25℃，湿度45%～65%，氨浓度<20 mg/L，换气量1.27 m/h。

1.2 试剂及仪器 显微镜(日本OLYMPUS，CX31-12C04)；石蜡切片机(德国Leica，RM2235)；电热水器；温度计；量筒(200 ml)；HE染液；京万红烫伤膏(天津达仁堂京万红药业有限公司，Z12020440)；欣帝大蒜素注射液(济南利民制药有限责任公司，H20046064)；芝麻油；生理盐水；白细胞介素(interleukin，IL)-6试剂盒、IL-10试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒(上海生工生物)；β-actin抗体、PERK抗体、P-eIF2α抗体、CHOP抗体、Bax抗体、Caspase-12抗体、Bcl-2抗体、Cleaved Caspase-3抗体(美国CST)；BCA蛋白定量试剂盒(美国赛默飞)。

1.3 实验方法

1.3.1 配制大蒜素油 以大蒜素注射液为母液，用无菌芝麻油分别将母液稀释为10%、5%、1%的浓度。

1.3.2 烫伤模型制作 将50只SD大鼠随机分为A、B、C、D、E组，每组各10只。各组大鼠造模前根据体质量以0.3 ml/100 g腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液实施麻醉。待大鼠麻醉后，取硫化钠溶液在大鼠背部脱毛，并用生理盐水擦净脱毛液。将盛90℃热水的量筒底部置于大鼠背部15 s，面积接近10%总体表面积，构建深Ⅱ度烫伤模型[8]。见图1。烫伤模型构建好后立即生理盐水5 ml腹腔注射。大鼠醒后分笼饲养，自由进食饮水。A组涂抹芝麻油作为阴性对照组，B组涂抹京万红烫伤膏作为阳性对照组，C、D、E组分别涂抹10%、5%、1%大蒜素油。

图1 大鼠深Ⅱ度烫伤模型制作

1.3.3 烫伤创面处理 烫伤6 h后对大鼠进行给药处理，在大鼠清醒条件下，对创面进行双氧水消毒，再根据分组分别将0.5 ml不同浓度大蒜素油、1.0 g京万红烫伤膏、0.5 ml芝麻油均匀涂抹在大鼠的烫伤创面上，给药频次为12 h 1次，连续给药直至大鼠创面全部愈合。每天观察烫伤创面具体愈合状态，记录溃破、渗出、感染情况，以全部上皮覆盖作为创面愈合的标志。

1.3.4 标本取材及处理 烫伤后12 d，取创面组织标本固定在4%甲醛溶液内，石蜡包埋后切片，HE染色，光镜下观察组织学特征。

1.3.5 分子生物学检测 烫伤创面MDA、SOD、CAT含量测定：取0.1 g烫伤创面组织加入生理盐水制成10%组织匀浆，置离心管中以3 000 r/min离心15 min，取上清液，硫代巴比妥酸法测定MDA，黄嘌呤氧化酶法测定SOD，高锰酸钾滴定法测定CAT。血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平测定：将大鼠眼球血以3 000 r/min离心15 min，取上清液酶联免疫法测定血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平。

1.3.6 Western Blotting检测 每1 ml蛋白裂解液RIPA中加入20 μl(50×)蛋白酶抑制剂储存液，使抑制剂终浓度为1 mmol/L。取0.1 g烫伤创面组织加入上述蛋白裂解液制成组织匀浆，冰上孵育0.5 h，3次旋涡振荡，4℃下12 000 r/min离心30 min(半径为12 cm)，将上清液转移至干净EP管内，BCA法检测各组样本中的蛋白质浓度，分装后置于-80℃冰箱保存。取40 g蛋白样品进行电泳，然后转移至硝酸纤维膜，50 g/L牛血清白蛋白TBST缓冲液室温封闭硝酸纤维膜，再加入不同的一抗孵育4℃过夜。TBST缓冲液3次洗涤后加入二抗孵育1 h，TBST缓冲液3次洗涤膜后加入ECL发光液，曝光，成像。软件检测各条带灰度值，结果用目的条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。

2 结果

2.1 各组大鼠创面愈合情况比较 用药后12 h，C、D组创面淤血呈斑块状散开，其他组创面淤血仍为片状。3 d内，各组创面均红润；3 d后，D组创面水肿、淤血大多消失不见。随着给药时间延长，C、D组肉芽组织明显生长，创面缩小显著。B、C、D、E组创面均未出现感染；A组创面部分出现红肿，创面痂下有积脓出现。7～11 d，B、C、D、E组创面痂皮出现大量脱落，创面逐渐与皮面平整，基本填充了肉芽组织；而A组创面痂皮仅出现部分脱落，创面低于皮面，可以发现薄层肉芽。12 d时，B、C、D、E组创面大部分已愈合，而A组创面愈合时间出现了一定程度的延迟。5组中，D组创面愈合时间最短(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠烫伤创面愈合时间比较

2.2 各组大鼠创面病理切片结果比较 伤后12 d取创面组织标本制作病理切片光镜下观察。C、D、E组镜下可见上皮明显增生且较为完整，已近似于正常鳞状上皮，真皮浅层部位可发现少量炎症细胞浸润，存在轻微炎症反应，残存毛囊可见再生修复。A组可见上皮增生不明显且不完整，表面可见渗出物形成的结痂，部分表皮坏死层附着，炎症细胞开始减退，部分创面出现感染，大量炎症细胞浸润，炎症反应明显，创面出现一定程度的加深，可累及至真皮的深层残存附件。B组上皮增生明显但不完整，可见增生的上皮呈舌状，上皮细胞轻度水肿，真皮浅层发现浸润大量炎症细胞，炎症反应较为明显。见图3。

图3 各组大鼠创面病理切片(a.A组；b.B组；c.D组)

2.3 各组大鼠创面组织MDA、SOD、CAT水平比较 D组MDA水平低于A组和B组，B组低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。D组SOD、CAT水平高于A组和B组，B组高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠创面组织MDA、SOD、CAT水平比较

2.4 各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比较 D组IL-6、TNF-ɑ水平低于A组和B组，B组低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。D组IL-10水平高于A组和B组，B组高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

2.5 各组大鼠创面组织蛋白表达程度比较 与A、B组比较，D组PERK、P-eIF2α、CHOP蛋白表达程度显著降低(P<0.05)。见图4。与A、B组比较，D组Bax蛋白表达程度显著降低，Bax/Bcl-2下降(P<0.05)。见图5。与A、B组比较，D组Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表达程度显著降低(P<0.05)。见图6。

图4 各组大鼠创面组织PERK、P-eIF2α、CHOP蛋白表达

图5 各组大鼠创面组织Bax、Bcl-2蛋白表达

图6 各组大鼠创面组织Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表达

3 讨论

制作动物皮肤烫伤模型的方法很多，激光、恒温恒压电烫仪、手提压力蒸汽消毒器等可通过精确控制温度、压力、时间及烫伤面积获得恒定的、有重复性的烫伤模型，但方法较为复杂，成本高，使用不方便。本研究参考相关文献[8]，找到了一种利用量筒、温度计、电热水器制作的可控温度、压力及面积的大鼠烫伤装置，其不仅能够达到获得不同深度烫伤模型的要求，还具有简单、经济、使用方便、重复性好等优点。

烧烫伤创面的主要致病菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌，且耐药现象严重[9]。大蒜素是一类广谱抗菌药，能够抑制和杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，以及包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的多种耐药菌[10-12]。但大蒜素对皮肤有较强的刺激作用，高浓度大蒜素直接用于创面会引起剧烈疼痛，用芝麻油稀释大蒜素可降低大蒜素的不稳定性，减轻臭味和对皮肤的刺痛腐蚀作用，同时增加大蒜素的皮肤渗透性。因此，本研究将大蒜素溶于芝麻油，制成不同浓度的大蒜素油。本研究结果显示：5组大鼠中，D组创面愈合时间最短(P<0.05)；C、D、E组伤后12 d病理切片光镜下可见创面无感染，炎症反应轻。即接受5%大蒜素油处理大鼠的创伤愈合时间最短，效果最好。10%大蒜素油效果不及5%的原因可能为高浓度大蒜素对新生肉芽组织具有一定的刺激性。

大蒜素对烫伤创面愈合的促进作用可能与其抗炎作用、抗氧化应激作用有关。在动物实验中，大蒜素可抑制二甲苯性小鼠耳廓肿胀和大鼠蛋清性足肿胀的急性渗出性炎症[13-14]。有研究表明，大蒜素能够抑制TNF-α、诱导型一氧化氮合酶及其产物一氧化氮、核因子κB、粘附分子的表达，调节IL，发挥抑制炎症反应的作用[15-17]。在炎症的病理条件下，白细胞分泌大量超氧负离子，其通过自发歧化作用转化为H2O2，大量的超氧负离子和H2O2可通过Fenton型Haber-Weiss反应产生损伤作用更强的羟自由基，羟自由基会进一步造成核酸、蛋白质及脂质损伤。有研究发现，大蒜素具有抗氧化、清除自由基的作用，能够对炎症引起的自由基损伤起到一定保护作用[18-21]。本研究结果显示：D组IL-6、TNF-ɑ水平低于A组和B组，B组低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)；D组IL-10水平高于A组和B组，B组高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。即5%大蒜素油可显著减少烫伤大鼠血清中IL-6、TNF-α，增加IL-10，这提示，大蒜素对深Ⅱ度烫伤创面具有抗炎作用。此外，烧烫伤创面发生不完全氧化会产生大量活性氧，抗氧化酶SOD、CAT过度消耗也会导致活性氧蓄积，引起氧化应激反应。SOD是活性氧在生物体内的高效催化剂，SOD催化活性氧发生还原反应生成H2O2，而CAT可以进一步还原H2O2生成水和氧，因此，SOD、CAT对调节活性氧平衡至关重要[22]。MDA是活性氧氧化脂质反应的终产物，在一定程度上反映活性氧的代谢程度[23]。本研究中：D组MDA含量低于A组和B组，B组低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)；D组SOD、CAT含量高于A组和B组，B组高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。即5%大蒜素油可显著降低烫伤组织中MDA含量，提高SOD、CAT活性，这提示，5%大蒜素油对大鼠深Ⅱ度烫伤创面的氧化应激具有抑制作用。

内质网应激是细胞调节蛋白质稳态、钙离子平衡、脂质代谢、炎症反应及保护细胞功能的重要病理生理过程[24]。内质网膜上的PERK分子是内质网应激调控蛋白质稳态、维持线粒体正常生理功能及细胞内环境的重要组成部分。病理状态下，内质网应激PERK信号通路被激活，上调CHOP、Bax等表达，导致线粒体结构功能障碍，释放活性氧等凋亡因子。过量的活性氧会活化促炎症蛋白酶Caspase-1，使IL-1β、IL-6等炎症因子异常增加，促进细胞凋亡及炎症性坏死[25]。有研究报道，烧烫伤可激活内质网应激反应，严重影响细胞及机体代谢，即内质网应激可能作为治疗烧烫伤的重要靶点[7]。本研究结果显示：与A、B组比较，D组PERK、P-eIF2α、CHOP、Bax、Caspase-12、Cleaved Caspase-3蛋白表达程度显著降低，Bax/Bcl-2下降(P<0.05)。这提示，大蒜素治疗烫伤创面的机制可能是抑制内质网应激相关PERK/P-eIF2α/CHOP通路。

综上所述，大蒜素可减轻SD大鼠深Ⅱ度烫伤炎症反应，缩短创面愈合时间，其机制可能与大蒜素抑制内质网应激相关PERK/P-eIF2α/CHOP通路有关。