诱导性低温对失血性休克大鼠再灌注后肠屏障功能影响

王小磊， 柳云恩， 单永琪， 李 达， 高广荣， 石三保， 张 婕， 张 成

1.锦州医科大学北部战区总医院 研究生培养基地，辽宁 沈阳110016；2.北部战区总医院 普外科，辽宁 沈阳 110016

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)为严重威胁人类生命的主要原因之一[1]，由于HS状态下血液的重新分配，肠道可能会出现缺血缺氧状态，使肠黏膜屏障功能发生障碍，大量肠源性损伤性因子发生移位，最终导致HS患者发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)与多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等严重并发症[2-4]。既往研究发现，HS发生时自发性低体温的出现标志着更为严重的预后[5-7]。然而，有计划的诱导性低温(inducible hypothermia，IH)已证实是改善HS患者近远期预后及降低病死率的一种重要治疗手段[8-10]。IH可在HS发生时降低机体对能量的需求，减缓新陈代谢，使机体进入类似“假死”状态，从而保护细胞器官免受缺血再灌注损伤，改善HS预后。本研究旨在通过建立HS大鼠动物模型，探讨IH对HS再灌注后肠屏障功能的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 高速冷冻离心机(沈阳医疗器械有限公司)；BL-420E多导生理记录仪(成都金凤有限公司)；光学显微镜(OLYMPUS)；酶标仪(美国 Bio-Rad公司)；组织匀浆机(上海季诺科贸有限公司)；红外线灯(安宏达光电科技)；动物肛温计(北京冀诺泰科技发展有限公司)；大鼠手术器械 1 套(沈阳医疗器械有限公司)；10%的水合氯醛(上海颖心实验室设备有限公司)；肝素钠注射液(南京新百药业有限公司)；0.9%氯化钠溶液(华仁药业股份有限公司)；酶联免疫吸附剂测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；标记葡聚糖(上海懋康科技有限公司)

1.2 大鼠HS模型的建立 Wistar大鼠，体质量180～200 g，以10%的水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔内注射麻醉成功后，于右侧股动脉及左侧颈总动脉插管(PE-50)分别用于放血和监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，右侧颈静脉插管用于液体复苏时回输液体。进行气管插管和小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量为7～8 ml/kg，呼吸频率为60次/min，吸入氧浓度为40%。放血量按20 ml/kg体质量计算，放血速度为0.5 ml/min，放血时间在10 min内完成，直至MAP达到50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右。维持时间为90 min，期间可通过股动脉放血或回输血维持MAP稳定。90 min后，回输放出的血和3倍放血量的林格氏液，并监护6 h。

1.3 实验分组及方法 将32只大鼠随机分为常温复苏组与低温复苏组，每组各16只。常温复苏组手术插管后放血，复苏期间通过加热设备保持直肠温度为38℃；低温复苏组手术插管后放血，复苏期间通过酒精浴及吹风控制直肠温度为32℃。复苏期维持60 min，完成后各组于3 h分别处死8只大鼠，剩余大鼠用于72 h生存分析。采集血液、肠系膜淋巴结及小肠组织标本待检测。

1.4 末段回肠段通透性检测 通过检测血浆异硫氰酸荧光素标记葡聚糖(FITC-dextran 4KD FITC，FD4)浓度来评估肠道通透性[11]。大鼠复苏完成后，腹部消毒备皮。取腹部正中切口，充分显露小肠组织。将肠组织翻出置于生理盐水浸泡过纱布上，选取末段回肠约4 cm肠管，5-0手术缝合线结扎肠段远近端。避光环境中，无菌1 ml注射器吸取50 μl FD4溶液，注入结扎肠段中后，缓慢将肠组织放入腹腔，缝合腹部切口。3 h后，打开腹腔，门静脉取血。门静脉血以3 000 r/min的速度离心10 min，吸取上清入600 μl入离心管中，用于检测血浆FD4浓度,进而反映肠道通透性变化。

1.5 血清炎症细胞因子的检测 采用大鼠酶联免疫吸附剂测定试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8和IL-10浓度。经标准品的稀释与加样、加样、温育、配液、洗涤、显色、测定，计算出各组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10表达水平。

1.6 细菌移位的测定 将肠系膜淋巴结称重，并置于含有0.5 ml冰冷磷酸缓冲盐溶液的研磨管中，用研磨机研磨成匀浆，将每份250 μl的匀浆涂在培养基上。于37℃有氧培养，24 h后检查平板。

1.7 小肠组织病理学变化 取大鼠距离回盲部10 cm的末段回肠组织，甲醛溶液固定，常规脱水石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色后，光镜下观察形态学变化。采用Chiu氏6级评分法[12]评估小肠组织损伤程度。

2 结果

2.1 两组大鼠小肠壁通透性比较 低温复苏组大鼠小肠血浆中FD4浓度为(0.91±0.12)μg/ml，明显低于常温复苏组的(1.25±0.12)μg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠在HS后小肠壁通透性增大，使标记葡聚糖大量进入血液中，而诱导性低温疗法能够明显降低大鼠小肠壁的通透性。

2.2 两组大鼠血清炎症因子含量比较 采用ELISA法对大鼠血清炎症相关因子进行检测，低温复苏组大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8均明显低于常温复苏组，IL-10明显高于常温复苏组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 两组大鼠血清炎症因子含量比较

2.3 两组大鼠肠系膜淋巴结的细菌含量比较 低温复苏组大鼠肠系膜淋巴结平均细菌移位量为(21.34±0.91)CFU/g，明显低于常温复苏组的(45.25±0.54)CFU/g，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 两组大鼠肠黏膜病理变化 常温复苏组光镜 下病理改变：小肠黏膜层水肿明显，上皮层和固有层间隙部分分离，重度炎细胞浸润，小肠绒毛萎缩，排列紊乱。低温复苏组光镜下病理改变：小肠黏膜组织较完整，排列整齐，上皮层下间隙轻度水肿，少量炎细胞浸润，小肠绒毛排列整齐。见图2。常温复苏组大鼠的小肠黏膜损伤程度评分为(3.25±0.71)分，显著高于低温复苏组的(2.13±0.84)分，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 两组大鼠肠黏膜病理变化(a.常温复苏组；b.低温复苏组；HE×200)

2.5 两组大鼠生存情况比较 两组大鼠在休克期及复苏期均无死亡。常温复苏组4只大鼠分别于250、310、410、500 min死亡，低温复苏组大鼠全部存活。Kaplan-Meier生存分析显示，常温复苏组、低温复苏组组间比较，存活率分别为50.0%(4/8)、100.0%(8/8)，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

HS作为创伤及外科手术后的常见并发症，已经成为严重威胁人类生命健康的重要原因[1]。尽管通过损伤控制性手术控制出血后辅以合理的液体复苏策略可有效改善大部分患者的临床预后，但仍有部分患者肠黏膜上皮细胞因无氧代谢和酸中毒而受损，导致正常肠黏膜屏障功能遭受破坏，肠腔内大量的细菌与内毒素通过淋巴或血循环移位至其他组织器官，最终引起SIRS甚至MODS等严重并发症,导致治疗失败[2-3,13]。因此，肠黏膜屏障功能的损害程度与HS患者的预后密不可分。

IH可以改善能量代谢失衡，减轻炎症反应，保护组织免于缺血再灌注损伤，同时增强机体耐受性，延长救治的“黄金时间”，从而改善HS的预后[8-10]。Shi等[14]通过制作大鼠HS模型，研究低温治疗对大鼠的影响，结果发现，在HS的情况下给予IH治疗可以提高长期存活率，并减弱了HS后的炎症反应。分析其原因，IH可以通过降低氧需求，保存组织ATP水平，降低代谢率，并减少缺血再灌注后活性氧自由基的产生，进而保护器官免受缺血性损伤，提高细胞功能和存活率。有研究发现，对HS大鼠进行IH治疗后减少了大鼠肠系膜循环中白细胞的粘附和肥大细胞的脱粒，减轻了炎症反应程度，改善了HS大鼠的预后[15]。

在HS的情况下，低温的潜在有害影响仍存在争议，其可能影响血小板和凝血因子功能，导致凝血机制障碍；影响心肌收缩性和血管反应性，导致循环系统崩溃；影响白细胞游走能力及免疫反应，导致机体抵抗力下降等[5-7，16]。肠道是HS及缺血-再灌注损伤时最易受累的器官，也是应激反应的中心[17-20]。细菌移位是导致HS患者不良预后的关键。本研究结果发现，与常温复苏组比较，低温复苏组大鼠血浆中FD4浓度及肠系膜淋巴结中的细菌移位量显著降低。这提示，IH能够降低HS大鼠小肠壁的通透性。本研究结果还显示，与常温复苏组比较，低温复苏组大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β等表达水平均明显降低，且抑炎因子IL-10的表达水平明显增高。这些数据提示，IH可以有效减轻HS大鼠炎症反应程度，且这一趋势与肠黏膜病理损伤程度相吻合，更进一步证实IH能够显著降低肠黏膜损伤程度，进而减轻肠屏障功能障碍，抑制肠道内肠源性损伤因子易位，减轻全身炎症反应。此外，对大鼠的72 h生存分析结果也提示，IH可能是提高存活率、改善预后的重要治疗策略。

综上所述，诱导性低温复苏可有效抑制大鼠失血性休克后炎症反应，改善肠屏障功能和黏膜组织损伤，从而提高存活率。这可能为HS后SIRS和MODS的防治提供新的思路，但如何确定IH的最佳维持时间和复温时机并广泛应用于临床实践中仍需更多大规模研究进一步证实。