七氟烷对低温环境下失血性休克猪心肌保护作用及其对信号转导及转录激活因子蛋白活性影响研究

王 丽， 郑晶晶， 张铁铮， 刁玉刚

北部战区总医院 麻醉科，辽宁 沈阳 110016

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)可因机体短时间内大量失血、失液引发，为外科最常见的急症之一[1]。低温条件下发生的HS不同于常温下的低血容量休克，具有特殊的病理生理特点，可引起心功能障碍，心力衰竭，最终出现多器官功能障碍甚至衰竭等严重后果[2]。HS过程中，损伤心肌局部或整个心肌组织可产生大量的炎症因子及氧自由基，为造成心肌缺血缺氧损伤的重要原因之一[3]。Janus激酶/信号转导与转录激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信号通路为介导炎症介质过度表达的重要通路之一，诸多细胞外信号均可通过JAK-STAT途径发挥作用，对HS心肌损伤的发生、发展及转归起到重要作用[4]。有研究证明，七氟醚后处理对缺血再灌注大鼠具有一定的心肌保护作用[5]，但低温环境下七氟烷后处理心脏保护的机制尚未完全阐明。肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)浓度在心血管疾病中特异性较高，主要分布于心肌细胞中，当心肌细胞损伤严重或坏死时，可释放入血。肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)升高意味着心肌损伤，可见于严重心力衰竭患者。本研究通过观察七氟醚对低温环境中HS心肌的保护作用，并探讨其可能的机制，旨在为防治HS心肌损伤提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备 24头巴马小型猪，雌雄各半，体质量20～25 kg，月龄3～5个月。所有实验动物均由北部战区总医院医学实验动物科提供。采用随机数字表法将其分为假手术组(S组)、HS组与七氟烷后处理组(Post/Sev组)，每组各8头。S组：不放血，仅穿刺双侧股动脉、颈内静脉置管观察。HS组：参考文献[6-7]，采用容量控制法建立巴马小型猪HS模型。实验前禁食12 h，自由饮水。肌肉注射阿托品0.05 mg/kg，30 min后，肌肉注射兽用速眠新Ⅱ号0.15～0.20 ml/kg麻醉，仰卧固定于实验台，气管插管后行机械通气，呼吸频率14～16次/min，潮气量8～10 ml/kg，吸入氧浓度25%。腹股沟备皮后，无菌条件下，0.5%利多卡因浸润麻醉，分离左侧股动脉置管，用于监测有创动脉压；右侧股动脉穿刺置管，用于放血。实验过程中每隔1 h肌肉注射兽用速眠新Ⅱ号0.15～0.20 ml/kg维持麻醉。经股动脉于15 min内匀速将40%～50%血容量(按30 ml/kg计算)放出，使平均动脉压降至35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。通过回输或放血的方法维持60 min后，视为模型制备成功。Post/Sev组：麻醉置管建立HS模型后，吸入2%七氟烷30 min，观察4 h。实验中低温环境设定为-5℃～0℃，直至实验结束移出冰柜。

1.2 血清CK-MB浓度检测 分别于休克前(T0)、休克后0.5 h(T1)、休克后1.0 h(T2)、休克后1.5 h(T3)、休克后2.0 h (T4)、休克后3.0 h (T5)及休克后4.0 h(T6)，分别采集3组动脉血样各1.5 ml，保存于无菌离心管中，静置30 min后，采用TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)离心5 min，取上清液，于-80 ℃保存。应用全自动生化分析仪(Olympus AU640)检测3组血清CK-MB浓度。每次采血后均补充等容量的生理盐水。

1.3 心肌病理组织学观察 待HS模型成功建立4 h后，麻醉状态下处死动物，取心尖组织，10%中性甲醛溶液固定过夜、脱水、石蜡包埋、连续切片(厚4 μm)，HE染色，光镜下观察心肌病理学结果。

1.4 心肌组织炎性因子水平检测 取心尖组织，液氮中保存，制成10%组织匀浆。采用酶联免疫吸附法检测3组心肌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)水平。严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。

1.5 心肌组织蛋白含量检测 取心尖组织，采用Western blot法测定心肌磷酸化信号转导及转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1 phosphorylation，p-STAT1)。加入细胞裂解液及酶抑制剂，提取STAT1蛋白，离心后取上清液，用BCA试剂盒(sigma公司，美国)测蛋白浓度。将被检蛋白稀释至80 μg加入上样缓冲液，煮沸后行SDS-PAGE蛋白电泳，分离后转印至聚偏氟乙烯膜，聚偏氟乙烯膜经5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，加入STAT1一抗(稀释度1∶400，北京博鳌森生物技术有限公司)，4 ℃孵育过夜。洗涤缓冲液洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(稀释度1∶5 000，北京博鳌森生物技术有限公司)，室温孵育1 h，洗涤缓冲液漂洗滤膜。以化学发光检测试剂(南京森贝伽生物科技有限公司)显色后，测定条带光密度值，以β-actin条带为内参。以目的条带与β-actin条带光密度的比值反映目的蛋白表达水平。心肌磷酸化信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3 phosphorylation，p-STAT3)测定方法同p-STAT1。

2 结果

2.1 各组心脏病理组织学观察结果比较 S组心肌未见明显改变，心肌纤维排列整齐，胞浆、胞核及组织结构清晰；HS组心肌纤维肿胀，炎性细胞增多； Post/Sev组心肌纤维排列较整齐，偶见炎性细胞浸润，较少细胞形态异常，病理学损伤较HS组明显减轻。见图1。

图1 各组心脏病理组织学变化情况(a.S组；b.HS组；c.Post/Sev组；HE×400)

2.2 各组不同时间点血液中CK-MB水平比较 与T0时比较，HS组、Post/Sev组T1～T6时间点CK-MB含量均显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。与S组比较，HS组、Post/Sev组T1～T6时间点血液中CK-MB水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与HS组比较，Post/Sev组T1～T6时间点血液中CK-MB水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点血液中CK-MB水平比较

2.3 各组心肌组织中IL-6、TNF-α、cTnI、p-STAT1、p-STAT3水平比较 与S组比较，HS组、Post/Sev组心肌组织中IL-6、TNF-α、p-STAT1及p-STAT3水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与HS组比较，Post/Sev组心肌组织中IL-6、TNF-α、p-STAT1及p-STAT3水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组心肌组织中IL-6、TNF-α、cTnI、p-STAT1、p-STAT3水平比较

3 讨论

低温环境下的HS具有特殊的病理生理特点。有研究表明，早期体温下降时，机体通过降低基础代谢率来减少氧耗，但体温持续过低将会引起机体重要器官功能抑制，严重创伤合并HS的患者易发生心功能障碍[8]。损伤心肌局部或整个心肌组织可产生大量的炎症因子及氧自由基，这是心肌缺血缺氧损伤的重要原因之一。IL-6为反映心肌炎性损伤的敏感指标，与心肌损伤的程度及心脏继发性损害呈正相关，在心肌炎症损伤中起到调控作用[9]。TNF-α为机体损伤时出现最早的炎症因子并可通过多种信号途径，参与心血管疾病的病理生理过程[10]。本研究结果表明，与HS组比较，Post/Sev组心肌组织中IL-6、TNF-α水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示，低温环境下七氟醚后处理可减轻HS猪心肌损伤。

JAK-STAT信号通路是介导炎症介质过度表达的重要通路之一，是细胞因子信号由胞膜向核内传递的主要途径[11-12]。p-STAT1对心脏的作用主要表现在促进炎症反应；p-STAT3起到心脏保护的作用[13-16]。本研究结果表明，与HS组比较，Post/Sev组心肌组织中p-STAT1及p-STAT3水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示，七氟醚后处理可下调心肌STAT蛋白的表达，减轻心肌炎性反应。调节STAT蛋白的活性可能成为防治HS心肌损伤的新靶点，但目前STAT蛋白参与HS心肌损伤的确切机制尚不清楚，有待进一步探讨。

综上所述，七氟烷可抑制低温环境下HS猪心肌炎症反应，减轻心肌损伤，其机制可能与抑制心肌组织STAT蛋白活性有关。