复合丝素导管修复大鼠坐骨神经损伤的研究*

王钰清，葛 锐，姚 珂，张鲁中，杨宇民

（南通大学 教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通 226001)

目前对于性能优良的组织工程生物材料支架来说，生物材料的可降解性是材料学不可忽略的问题[1]。在临床医学研究中，不可降解材料在体内易对患者增加二次手术的风险。因此，寻找一种既有适宜降解速度又能发挥其功能的生物材料显得尤为重要[2]。这类生物材料将生物活性材料与可降解材料这两个独立的概念结合起来，旨在可降解材料上进行分子修饰，与细胞整合素结合，诱导细胞增殖、分化以及细胞外基质合成与组装，从而启动机体的再生系统，促进组织再生[3]。

丝素蛋白是自然界最丰富且来源最为广泛的生物材料之一，具有生物相容性好、力学性能优良等优点[4]。此外，丝素蛋白还具有可加工性，可用作各种形式的生物材料，如薄膜[5-6]、凝胶[7]等。丝素蛋白被广泛认为是生物相容性好，但分类为不可降解生物材料，丝素在植入体内1 年后会失去主要的拉伸性能[8]。体外实验[9]表明蛋白质酶可切断丝素蛋白非晶区域链段，使其分解为多肽而被细胞进一步代谢。但目前还未有相关报道阐明纯丝素蛋白支架在体内是否真正具有降解趋势，理论上讲其在体内降解是一个非常漫长的过程，这也是其被认定为不可降解材料的主要原因。经过不断的研究，可以通过制备较小分子质量的丝素蛋白从而加快丝素蛋白在体内的降解速度。但是小分子质量丝素蛋白支架在体内加快降解的同时，也降低了丝素蛋白自身的机械性能。丝素蛋白支架机械性能较低时，在手术缝合时缝合线的拉扯可能导致支架的结构和形态发生变化，从而降低支架在体内的修复效率。因此如何让小分子质量丝素蛋白在体内保持良好的机械性能是主要问题之一。

本研究拟选取课题组制备的分子质量约为100 ku和50 ku 的两种小分子质量丝素蛋白[10]，在此基础上制备了两种小分子质量的复合型丝素导管。这两种导管分别被用于植入大鼠体内用于修复大鼠坐骨神经缺损以及被植入兔子背部皮下用于观察丝素蛋白导管在体内的降解行为，将为丝素蛋白在外周神经领域的可调控降解与再生修复能力提供科学的理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器 桑蚕丝（南通仙基达茧丝制品有限公司)；戊巴比妥钠、神经丝（neurofilament，NF)蛋白抗体（NF 160/200 antibody)、聚乙二醇辛基苯基醚（Sigma 公司，美国)；S100 β 蛋白抗体、山羊抗兔IgG H&L（488)、山羊抗鼠IgG H&L（488)、山羊抗兔IgG H&L（cy3)、山羊抗鼠IgG H&L（cy3)（Abcam 公司，上海)；免疫荧光封闭液、苏木精-伊红染色液（上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS)（CORNING 公司，美国)；JEM-1230 透射电子显微镜（HITACHI 公司，日本)；ZEISSAX10 正置研究级光学显微镜（ZEISS 公司，德国)；冰冻切片机（Leica 公司，德国)；冷冻干燥机（VirTis 公司，美国)。

1.2 不同分子质量复合型丝素导管的制备 （1)不同分子质量丝素蛋白溶液制备:参考L.Z.ZHANG等[1]的方法制备不同分子质量的丝素蛋白溶液，得到分子质量约为100 ku（SF30)和50 ku（SF180)的两种小分子质量丝素蛋白。（2)不同分子质量复合型丝素导管的制备:①将制备的两种分子质量的丝素蛋白溶液分别在冷冻干燥机上冻干；②在直径为2 mm的金属导管模具上进行静电纺丝8 h，完成后将导管浸泡在无水乙醇中4 h，晾干并用实验室自制的编织机编上一层丝素线；③将冻干机上冻干的两种分子质量的丝素蛋白取出，分别配制25%甲酸丝素涂层溶液，均匀涂抹在相应的金属导管上，放入60 ℃烘箱烘2 h；④重复上述涂层步骤继续烘干，二次烘干完成后将导管浸泡在70%乙醇溶液中数天取下，所得导管标记为SF30 和SF180。

1.3 体内降解检测 通过构建兔子模型进行体内降解检测。成年雄性新西兰大耳白兔，体质量（2.2±0.5) kg，由南通大学实验动物中心提供。将干燥的导管剪成1 cm 的小段，并进行编号、称重，此时导管的初始重量记为m1，灭菌待用。模型制备:将兔子深度麻醉后，背部进行剃毛并用碘附消毒，背部剪开6 个小孔，将导管依次进行皮下植入，并对兔子进行编号。模型制备完成后10、20、30、90、180 d 进行取材，之后轻轻剥去导管外侧和内侧的组织，清洗干净后放入烘箱烘干至恒重，并称重，此时每根导管的重量记为m2，降解率/%=（m1-m2)/m1×100。本实验方案获南通大学实验动物伦理委员会批准（S20181201-303)。

1.4 大鼠坐骨神经缺损桥接模型的制备 成年Sprague-Dawley（SD)大鼠，体质量为200 g，雄性，由南通大学实验动物中心提供。将92 只SD 大鼠随机分成4 组，即缺损组、自体组、SF30 组和SF180 组。每组再分1、4、8、12 周4 个时间点。将大鼠腹腔麻醉，予左侧下肢剃毛，用碘附对剃毛处进行消毒。暴露大鼠坐骨神经，制备各组模型:缺损组，将大鼠坐骨神经剪去约1 cm 的坐骨神经段，不处理神经立即缝合肌肉和皮肤；自体组，将大鼠坐骨神经剪去1 cm，对神经的两断端进行缝合，随后缝合肌肉和皮肤；两种分子质量的导管组:将大鼠坐骨神经剪去1 cm，取长度约为1 cm 的导管，将神经的两断端搭在导管的两端进行缝合，随后缝合肌肉和皮肤。模型制备完成后按上述时间点进行灌注取材，并做后续的指标分析。本实验方案获南通大学实验动物伦理委员会批准（S20180805-304)。

1.5 苏木精-伊红染色 将导管和坐骨神经按照1、4、8、12 周的时间点进行取材后，纵切导管，制备冰冻切片，厚度为12 μm。用双蒸水洗涤切片，苏木精染色20 min；用0.5%盐酸乙醇分色，在流水下蓝化20 min；然后用伊红染色60 s，随后浸泡于50%、70%、80%、90%和无水乙醇中梯度脱水，5 min/次；再浸泡于乙醇和二甲苯（1∶1 体积比)混合溶液中5 min；最后置于二甲苯溶液中洗涤3 次，用中性树脂封片，吹干用蔡司显微镜拍照观察。

1.6 免疫组织化学染色 用PBS 清洗切片数次，免疫荧光封闭液封闭1 h；再用PBS 清洗3 次，10 min/次；4 ℃冰箱中孵育一抗（1∶400)过夜；第2 天洗去一抗，用PBS 清洗3 遍，10 min/次；然后孵育二抗488（1∶400)和cy3（1∶400)，室温孵育3 h；PBS 洗涤3 次，加入封片液封片，并用蔡司显微镜拍照。

1.7 透射电镜检测 术后3 个月对大鼠麻醉后活体取材，取出导管后轻轻剥去导管，暴露导管内部新生的坐骨神经，取出远端侧神经并放入预冷的戊二醛中固定。后经1%锇酸固定、醋酸铀块染、梯度乙醇脱水、半薄切片定位、超薄切片、枸橼酸铅复染等步骤，采用透射电镜拍照观察远侧端再生髓鞘情况。

1.8 靶肌湿重比计算 模型制备完成后，按照相应时间点取大鼠后肢术侧和健康侧的腓肠肌和胫前肌，并用分析天平称重并记录，采用术侧与健康侧的比值计算相应组别的靶肌湿重比。

1.9 统计学方法 实验数据均用GraphPad Prism5软件进行作图和统计分析，Photoshop CS6 软件进行图片处理，数据以表示。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分子质量复合型丝素导管的安全性评价及功能性评价

2.1.1 体内降解 导管的体内降解主要是将导管植入兔子皮下并将导管逐个称重，在相应时间点将导管取出再称重最后进行统计。在30 d 时，两种导管的降解率均接近40%，降解速度较快；到90 d 时，降解速率明显放缓；最后到180 d 时，两种导管降解率均＞50%，其中SF180 的导管降解率近70%（图1)。

图1 不同分子质量的复合丝素蛋白导管在体内的降解率

2.1.2 苏木精-伊红染色 通过苏木精-伊红染色的手段观察这两种导管在体内的炎症反应。由图2（见封三)可见，植入1 周后中性粒细胞引起轻微炎症反应；4 周时，导管周围开始出现多核细胞，可能是慢性炎症产生的巨噬细胞融合引起。表明植入导管1个月后体内的炎症反应明显减轻；在8 周和12 周时，导管四周几乎看不见单核细胞和多核细胞，表明两种导管在植入后期无明显炎症反应。

图2 植入大鼠体内两种导管的苏木精-伊红染色（Bar=100 μm)

2.2 复合型丝素导管的功能性评价

2.2.1 再生轴突和髓鞘染色 用NF 和S100 两种抗体来标记再生坐骨神经的轴突和髓鞘，通过免疫组织化学染色观察导管内部坐骨神经再生的情况。由图3（见封三)可见，1 周时缺损组坐骨神经的近端和远端没有连接生长，且远端的轴突与髓鞘还未退化；而在导管组中，两种导管内部呈现中空的结构，并未出现坐骨神经再生，自体组再生效果最好。在4周时，缺损组的远端神经出现轴突和髓鞘退化现象；而在导管组中，导管的近端神经逐渐向前生长，表现出明显的再生轴突和髓鞘，远端也未出现明显的轴突和髓鞘退化现象。在8 周和12 周时，缺损组的近端和远端逐渐连接在一起，12 周时缺损组的坐骨神经边缘出现少量轴突和髓鞘组织，但在内部为中空状；在导管组中，坐骨神经开始出现明显的再生过程。在12 周时两个导管组内部出现明显的轴突和髓鞘组织，并直接贯穿于整个导管组织，表明导管内的大鼠坐骨神经再生成功。

图3 导管内坐骨神经的再生轴突和髓鞘的免疫荧光染色

2.2.2 神经远端透射电镜观察 通过透射电镜来观察3 个月导管内远端再生神经的髓鞘，将神经取材用戊二醛固定及超薄切片染色后进行观察。由图4可见，缺损组胶原纤维和髓鞘共存，而自体和导管则没有胶原纤维存在，表明导管组和自体组再生神经效果均好于缺损组。此外，从髓鞘厚度来看，缺损的髓鞘厚度相对较薄，自体组的髓鞘厚度最厚，导管组的髓鞘厚度比自体组略薄，但明显厚于缺损组。髓鞘是神经系统发展过程中必不可缺少的结构，其主要由脂质和蛋白质相互排成层状，因此髓鞘的层状越厚表明髓鞘形成越好。因此，该透射结果也表明两种导管所再生的髓鞘效果良好。

图4 术后3 个月坐骨神经远端透射电镜图（Bar=5 μm，250 nm)

2.2.3 靶肌湿重比 在神经缺损发生后会患者造成感觉和功能丧失之外，还会导致周围肌肉萎缩。在大鼠坐骨神经缺损并用制备的导管桥接手术后12 周，对大鼠的后肢健康侧和术侧的腓肠肌和胫前肌进行灌注取材，并计算其湿重比。由图5 可见，缺损组胫前肌和腓肠肌湿重比明显小于自体组和导管组，表明导管组和自体组的肌肉萎缩恢复效果明显优于缺损组，而导管组和自体组的靶肌湿重比差异无统计学意义，表现出导管的促神经再生应用价值。

图5 术后12 周腓肠肌和胫前肌肌肉湿重比统计（*P＜0.05)

3 讨论

众所周知，在外周神经损伤修复领域，除了自体移植这一金标准的修复办法外，神经导管移植物也逐渐成为临床有效的修复办法之一[11]。目前，由壳聚糖制备的神经移植物已经在临床试验中取得较好的修复效果，有学者[12]也致力于研究效果更好的神经移植物，其中神经移植物的降解和生物相容性成为至关重要的因素。本研究选取桑蚕丝素蛋白为主要材料制备了复合型丝素蛋白导管并对其在外周神经损伤修复领域的应用价值进行了研究。丝素蛋白经氯化钙/乙醇/水三元溶液分别溶解30 min 和180 min，分别得到100 ku（SF30)和50 ku（SF180)分子质量的可溶性丝素蛋白，这两种丝素蛋白红外光谱无明显差异[1]。可溶性丝素蛋白经乙醇变性得到不溶丝素蛋白支架材料，研究[2-3]表明，SF30 的丝素蛋白比SF180支架具有较好的力学性能和较慢的降解速度。考虑到丝素蛋白本身降解慢的问题，本研究制备了SF30和SF180 丝素蛋白用于改善丝素蛋白的降解速度。由于小分子质量的丝素蛋白机械性能较差，不足以支持体内实验，经过改善成功制备了机械性能较好的复合型导管，并将该复合型导管用于大鼠坐骨神经缺损1 cm 和桥接模型，桥接手术完成后在1、4、8、12 周对大鼠进行灌注取材并进行一系列的指标分析。此外，还单独对导管在兔子体内的降解反应以半年为周期进行观察，并对其降解率进行统计用于评估该复合型导管的降解效果。在最开始1 个月时，导管在兔子体内降解速率较快，可能是由导管的结构造成的[13]。该复合型导管主要分为3 层，最外层是小分子质量的丝素蛋白涂层，该部分是降解速率较快的主要原因；导管中层是编织的丝素线，该丝素未经任何处理所以较难降解，可以解释导管在体内30～90 d 降解率较为平缓的现象；导管的内部是小分子质量丝素的静电纺丝层，该部分降解较快。最终在180 d 时，两种小分子质量的导管降解率均＞50%，SF180 丝素蛋白支架降解速度快于SF30 丝素支架，原因在于SF180的导管降解速率显著高于SF30。从苏木精-伊红分析结果看，第1 周时表现为急性炎症反应，从第4 周开始炎症反应逐渐减轻直到消失，这两种分子质量的丝素蛋白支架炎症反应差异无统计学意义，表明该复合型导管在大鼠体内具有良好的生物安全性。

神经再生是一个较为复杂的过程，轴突和髓鞘的形成不可或缺[14]。因此采用NF 和S100 抗体分别标记轴突和髓鞘[15]，染色观察在1、4、8、12 周时导管内坐骨神经再生的过程。从染色结果中可以看出，4周时导管组神经出现明显的再生现象，8 周和12 周时导管内的坐骨神经有明显的轴突和髓鞘生成，表明这两种丝素蛋白导管虽然具有促进坐骨神经再生的功能，但两种分子质量的丝素蛋白之间差异无统计学意义。为了进一步观察再生的髓鞘，本实验针对术后3 个月的再生坐骨神经远端进行透射电镜观察，缺损组虽然有髓鞘生长，但仍存在大量胶原纤维；而导管组再生坐骨神经的髓鞘层厚度与自体移植组的层厚度相接近，表明导管组的坐骨神经髓鞘组织再生相对完好。坐骨神经缺损后除了会导致神经功能丧失，还会导致周围胫前肌和腓肠肌肌肉萎缩，神经再生后，肌肉萎缩程度明显改善[16]。从靶肌湿重比的结果来看，术后3 个月缺损组的肌肉萎缩近健康肌肉的一半，而导管组和自体组肌肉萎缩程度明显改善，与缺损组相比差异有统计学意义，但SF30 与SF180间差异无统计学意义。

本研究成功制备了复合型丝素蛋白导管，改善了丝素蛋白导管的降解问题以及机械性能。在大鼠坐骨神经桥接模型中，在12 周时SF30 与SF180 复合丝素导管均能明显促进大鼠1 cm 坐骨神经缺损再生，两种导管间差异无统计学意义；本研究制备的复合丝素导管在180 d 内降解率均＞50%，且SF180复合丝素导管降解速度显著快于SF30，有望实现支架降解与损伤恢复同步。本研究结果既为丝素蛋白导管对外周神经的临床试验提供了理论基础，同时也为丝素蛋白支架的降解提供了新思路。