胰岛素受体底物1基因多态性与多囊卵巢综合征疗效相关性研究*

丁易钤，卢 清

（江苏省南通市妇幼保健院妇科，南通 226018)

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌疾病，患病率为5%～10%[1]，PCOS 能严重影响患者的生殖功能，以及增加雌激素依赖性肿瘤、2 型糖尿病、代谢综合征等相关代谢失调发病风险[2]。对于临床上缺乏典型症状、体征及实验室依据及青春期的患者缺乏较为精准的诊断方法，对于各种不同的亚型缺乏相应的精准治疗策略及个体化的诊疗标准，临床效果欠佳。PCOS 的发病机制目前还不十分清楚，其相关分子机制的研究是当今女性生殖内分泌的研究热点和难点。G.A.BURGHEN 等[3]首次报道了高胰岛素血症与PCOS 有关。研究[4]发现胰岛素抵抗与高胰岛素血症在PCOS的发病中起着关键和早期的作用。胰岛素对卵巢的作用主要通过胰岛素受体来调节，胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS)是一种细胞内糖蛋白。IRS1 作为胰岛素受体后的主要船坞蛋白，其蛋白的表达和磷酸化异常是选择性胰岛素抵抗的主要机制。K.K.ALHARBI 等[5]也发现IRS1（rs1801278)与胰岛素受损相关。近年来，随着精准医疗的不断实践和发展，对一种疾病不同状态和过程进行精确分类，以便精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点。因此，本研究通过观察PCOS 患者的IRS1 基因多态性与药物治疗效应的关系，从而为今后PCOS 精准治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年7 月—2018 年7 月在南通市妇幼保健院就诊的PCOS 患者240 例，年龄20～30 岁，平均（26.31±23.61)岁，纳入标准:（1)符合PCOS 诊断标准:2003 年欧洲人类生殖和胚胎与美国生殖医学学会的（ESHRE/ASRM)鹿特丹专家会议推荐的标准[6]，以下3 项中符合2 项:①稀发排卵和（或)无排卵（月经周期＞35 d)；②临床高雄激素表现和（或)生化高雄激素血症；③卵巢呈多囊样改变，即超声检查见到:一侧或两侧卵巢有≥12 个、直径＜10 mm的小卵泡，或（和)卵巢体积增大＞10 mL。（2)既往未接受过治疗的患者。（3)知情同意，并签署知情同意书。排除标准:（1)对药物过敏者；（2)患有其他内分泌疾病患者；（3)近3 个月来服用激素类药物；（4)肝肾等重要脏器衰竭；（5)合并有高血压心脏病等病史；（6)临床资料收集不全者。选取同期240 名体检正常者作为正常对照组，年龄20～30 岁，平均（25.31±24.83)岁，纳入标准:（1)正常排卵（月经周期规律)；（2)激素水平提示均在正常范围内；（3)签署知情同意书。排除标准:（1)患有内分泌疾病患者；（2)近3 个月来服用激素类药物；（3)肝肾等重要脏器衰竭；（4)临床资料收集不全者。本研究经南通市妇幼保健院医学伦理委员会批准。

1.2 检测与治疗

1.2.1 胰岛素代谢相关基因IRS1 检测 抽取患者外周静脉血4 mL。血样经离心后于4 ℃保存。根据NCBI 数据库资料，选择汉族人群中IRS1 代谢酶杂合度＞10%，且与代谢酶活性密切相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点进行基因型分析。结合文献[5]报道，本研究选择rs1801278位点进行基因型分析。利用引物设计软件Premier 5.0，设计rs1801278 位点的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)引物，上游:5′-TCACCTCCTCTGCAGCAATG-3′；下游:5′-CCTTCCACATCCCCACCATC-3′，DNA 在20 μL 的反应体系和反应条件下行PCR 扩增，PCR 产物于1.5%琼脂糖凝胶（EB 染色)，110 V 直流电压下电泳30 min，以DNA marker DL600 为分子质量标准品，利用紫外线荧光凝胶成像系统检测PCR 扩增目的片段的结果。PCR 产物经紫外线荧光凝胶成像系统检测后一部分产物由上海赫贝公司测序，采用一代测序及变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC) 技术筛查多态位点分析rs1801278 位点基因型。

1.2.2 治疗方法 PCOS 患者不同基因型基础上分3 组，均予改善饮食并加强体格锻炼。空白组不服用药物；二甲双胍组服用二甲双胍缓释片（天津中新，国药准字J20120010，0.5 g/片)，0.5 g/（次·d-1)；口服避孕药+二甲双胍组在二甲双胍基础上加用达英-35（拜耳医药广州，国药准字J20100003，醋酸环丙孕酮2 mg 和炔雌醇0.035 mg，1 片/d，连服21 d，停药7 d后开始下一周期；共治疗6 个月。

1.3 观察指标

1.3.1 性激素水平 患者均抽取清晨空腹静脉血5 mL，12 000 r/min 离心10 min，获得血清，采用贝克曼DXI800 型化学免疫发光分析仪测定卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素（luteinizing hormone，LH)、雌二醇（estradiol，E2)、睾酮（testosterone，T)，试剂盒由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供，并进行质控。

1.3.2 胰岛功能 采用胰岛素化学发光法试剂盒（深圳市新产业生物医学工程股份有限公司)测定空腹胰岛素。胰岛素抵抗稳态模型（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

1.3.3 血脂水平 采用酶循环法测定三酰甘油（triglyceride，TG)、总胆固醇（total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL)及高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL)，试剂盒由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。

1.3.4 监测排卵情况 将飞利浦iU Elite C8-4V 型超声诊断仪阴道探头频率设置为7.5 MHz，未婚者行经腹部B 超检查，对卵巢行连续断层的纵切、横切扫查。进行卵泡监测，观察是否恢复排卵及进行优势卵泡监测。月经周期第11～12 天进行初次监测，以最大三维径线对卵泡直径进行计算，一般将直径＞10 mm的卵泡作为优势卵泡。根据优势卵泡的大小确定下一次监测时间，若最大卵泡直径＜10 mm，监测时间间隔6～7 d；若最大卵泡直径10～12 mm，监测时间间隔3～4 d，最大卵泡直径13～15 mm，监测时间间隔2～3 d。若最大卵泡直径16 mm，监测时间间隔1～2 d，B 超监测卵泡消失或塌陷，表明已排卵，记录排卵情况。

1.4 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件分析数据。计量资料以表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析；计数资料以例数（%)表示，采用χ2检验。采用χ2检验检测基因型是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs1801278 位点基因型分析结果 PCOS 组rs1801278 位点的CC 基因型频率低于正常对照组（P＜0.05)，TT 基因型频率显著高于正常对照组（P＜0.05)；CT 基因型频率两组间差异无统计学意义（P＞0.05)。PCOS 组T 等位基因频率显著高于正常对照组（P＜0.05)，均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，见图1、表1。

图1 rs1801278 基因型测序结果

表1 PCOS 组与正常对照组rs1801278 位点基因分析型结果（n，%)

2.2 不同基因型治疗后性激素水平比较 CC 基因型采用二甲双胍+达英-35治疗的性激素改善最明显，明显优于CT 和TT 型（P＜0.05)，见表2。

表2 不同基因型治疗后性激素水平比较（)

表2 不同基因型治疗后性激素水平比较（)

注:与空白组相比，aP＜0.05；与二甲双胍组相比，bP＜0.05；与CC 型相比，cP＜0.05。

2.3 不同基因型治疗后胰岛功能及血脂水平比较CC 基因型采用二甲双胍+达英-35治疗的胰岛素水平、HOMA-IR 及血脂改善均明显优于CT 和TT 型（均P＜0.05)，见表3。

表3 不同基因型治疗后胰岛功能及血脂水平比较（)

表3 不同基因型治疗后胰岛功能及血脂水平比较（)

注:与空白组相比，aP＜0.05；与二甲双胍组相比，bP＜0.05；与CC 型相比，cP＜0.05。

2.4 不同基因型卵泡监测结果 CC 基因型采用二甲双胍+达英-35治疗恢复自发排卵率达78.62%，明显优于CT 型（67.23%)和TT 型（61.62%)（P＜0.05)。

3 讨论

PCOS 是常见的女性生殖系统疾病，常导致不孕和自然流产等，严重危害女性身心健康，目前已认识到PCOS 的发病通常与激素、遗传及环境有关，但尚不完全清楚其发病机制[7-8]。国内外研究[9-10]显示胰岛素抵抗在PCOS 的发病中发挥关键作用，可能是PCOS 发生的主要病理基础。胰岛素抵抗引发的高胰岛素血症促进雄激素大量分泌，从而导致无排卵及闭经等生殖功能障碍[11]。IRS1 是胰岛素受体的酪氨酸激酶底物，参与介导胰岛素信号传导途径，与胰岛素抵抗关系密切[12]。

既往研究[13]表明，PCOS 是一种多基因遗传疾病，有较强的家族聚集性。IRS1 基因的rs1801278（C＞T)位点单核苷酸多态性可使细胞胰岛素刺激信号下降32%，通过PI3K 信号转导途径，使IRS1 表达下降，正常人群及糖尿病人群产生胰岛素抵抗。国外学者[14-15]报道rs1801278（C＞T)位点单核苷酸多态性有较高的突变频率，对指导2 型糖尿病和妊娠期糖尿病选择药物具有重要意义。研究[16]发现，正常对照中IRS1 基因突变率为16.6%，存在胰岛素抵抗的PCOS 患者IRS1 基因的等位突变率达39.3%，同时rs1801278 基因多态性是PCOS 患者发病的重要影响因素，因此推断基因的多态性对PCOS 患者的胰岛素抵抗起着重要作用。但关于PCOS 患者rs1801278（C＞T)位点单核苷酸多态性的国内研究则相对较少。本研究通过对IRS1rs1801278 进行DHPLC 及测序分析，发现3 种基因型分别为纯合子CC型、杂合子CT 型和纯合子TT 型。继而发现PCOS 患者与正常人群相比，发生TT 突变的频率明显增加，表明PCOS 患者T 等位基因可能是它的发病基因。为进一步研究基因型对药物的敏感性，故对所有基因型采用3 种干预措施，分别从性激素、胰岛功能、血脂及优势卵泡等方面观察药物疗效，结果显示CC基因型采用二甲双胍及二甲双胍+达英-35治疗的性激素水平、胰岛功能及血脂改善优势卵泡有效率明显优于CT 和TT 型，TT 型疗效最差（P＜0.05)。提示二甲双胍对CC 基因型患者疗效较好，同时联合达英-35 的疗效更为突出，一方面表明二甲双胍治疗rs1801278 位点野生型患者更具针对性、疗效更优、体现了个体化用药原则，但具体的药物基因组学机制尚需进一步研究；另一方面从药物种类选择上，无论是哪种基因型，二甲双胍+达英-35治疗的效果明显优于二甲双胍单独治疗，表明达英-35 协同二甲双胍明显增加了CC 基因型患者的疗效，达英-35通过与双氢睾酮竞争受体，抑制5-α 还原酶活性，降低雄激素水平疗效[17]，二甲双胍增强胰岛素敏感性，减缓PCOS 胰岛素抵抗，从而打破高雄激素和胰岛素抵抗之间的恶性循环，协同达英-35 降低雄激素水平[18]。

综上所述，二甲双胍联合达英-35治疗CC 基因型PCOS 患者疗效最优，TT 基因型最差，检测rs1801278 位点有助于选择个体化药物治疗以达到最佳疗效。因本研究样本量较小，存在一定偏倚，故需进一步扩大样本量加以证实。