玫瑰花破壁饮片HPLC指纹图谱及不同工艺样品比较研究

徐月阳，甘均龙，史军杰，潘均华，彭丽华，成金乐*

（1. 广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心，广东 广州 510006； 2. 中山市中智药业集团有限公司国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室，广东 中山 528437；3. 广州中医药大学 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006；4. 国家中成药工程技术研究中心 南药研发实验室，广东广州 510006）

明代姚可成《食物本草》首次记载玫瑰花，其味甘、微苦，性温，无毒，主利肺脾、益肝胆、辟邪恶之气，食之芳香甘美，令人神爽[1]。玫瑰花药材为蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，具有行气解郁、和血、止痛的功效，用于肝胃气痛、食少呕恶、月经不调、跌扑伤痛[2]等症的治疗。作为药食同源品种，玫瑰花的主要活性成分为黄酮类、挥发油类、多糖类、多酚类（主要为没食子酸）等[3-9]。现代药理学研究表明，玫瑰花具有抗疲劳、抗氧化、抗病毒、抑菌作用以及提高免疫功能，对急性心肌缺血损伤的保护作用等[10-16]。玫瑰花破壁饮片是将符合2020年版《中国药典》要求的玫瑰花传统饮片，经现代粉碎技术加工至粒径D90＜45 μm以上的粉体，后经无添加成型剂的专利技术制成30 ～ 100目的干燥颗粒，具有质量均一、成分高效利用、服用便捷等特点[17-20]。2020年版《中国药典》仅对玫瑰花药材的性状、鉴别和浸出物等进行要求，无法较全面的反映其质量特征。中药指纹图谱以化学成分为基础，能够较系统、全面地表征中药的物质基础概貌[21]。目前，国内外尚无玫瑰花破壁饮片的HPLC指纹图谱研究报道。本实验首次对玫瑰花破壁饮片开展HPLC指纹图谱研究，综合分析玫瑰花破壁饮片的化学成分信息，并以相似度评价比较玫瑰花传统饮片到破壁粉体再制成破壁饮片三者之间化学成分的相关性以及通过聚类分析和主成分分析比较玫瑰花破壁饮片小试与大生产工艺样品的区别，以期为玫瑰花破壁饮片及其原料的质量控制以及玫瑰花破壁饮片生产工艺评价提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Millipore TM-D24UV型超纯水机（美国密理博公司）；Waters 2695/2988型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

超纯水（自制）、甲醇、乙腈（色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司）、甲醇、磷酸（分析纯，广州化学试剂厂）、没食子酸（批号：110831-200803，纯度：90.1%，中国食品药品检定研究院）、鞣花酸（批号：MUST-19052603，纯度：99.65%，成都曼斯特科技生物有限公司）。

玫瑰花传统饮片：收集15批（详见表1）种植基地及主产地玫瑰花原药材，经中药师贾世清鉴定为蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosaThunb.的干燥花蕾，原药材净制，拣去杂质，摘除花柄及蒂，后经低温干燥制成传统饮片。

表1 玫瑰花样品信息Tab. 1 Sample information of Rosae Rugosae Flos

玫瑰花破壁粉体及破壁饮片：将上述15批传统饮片依次通过气流粉碎技术制备成15批破壁粉体（中间体）、再经“ 无添加成型”技术，进一步制备成15批破壁饮片成品（小试工艺样品）。

20批次大生产玫瑰花破壁饮片：生产批号依次 为15060203、20151101、20151201、20160301、20160902、16100102、20170302、20170303、17050102、17060202、20171202、20180101、20180103、20190504、20190503、20190502、20190501、20190203、20190202、20190201；样品编号依次为UGP16-UGP35。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido CAP Cell MGⅡ C18柱（ 250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序，见表2；流速：0.9 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：300 nm；进样体积：10 μL。

表2 流动相梯度洗脱程序Tab. 2 Mobile phase gradient elution program

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称定65批玫瑰花样品各0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声30 min，取出放冷至室温，用提取液补足减少的重量，摇匀，用滤纸滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称定鞣花酸、没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含没食子酸 0.08 mg、鞣花酸 0.13 mg的混合对照品溶液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 取编号为UGP1的玫瑰花破壁饮片，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液和80%甲醇空白溶液，进样，按“2.1”项下色谱条件。结果显示空白溶剂在色谱条件下无对应色谱峰，表明建立的方法专属性好。

2.3.2 精密度考察 取编号为UGP1的玫瑰花破壁饮片，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，同一样品连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录测定结果。以1号峰为参照峰，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3%，结果表明仪器的精密度良好。

2.3.3 重复性考察 取编号为UGP1的玫瑰花破壁饮片，平行6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下进行测定，记录测定结果。以1号峰为参照峰，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3%，表明分析方法的重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取编号为UGP1的玫瑰花破壁饮片，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h检测，记录测定结果。以1号峰为参照峰，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间均小于3%，表明24 h内供试品溶液的稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 指纹图谱采集 分别取15批次玫瑰花传统饮片（DP1-DP15）、破壁粉体（UP1-UP15）、破壁饮片（UGP1-UGP15）及20批次大生产玫瑰花破壁饮片（UGP16-UGP35），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，得到HPLC指纹图谱色谱图。

2.4.2 共有模式的建立及色谱峰的指认 将“2.4.1”项下得到的HPLC指纹图谱采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版进行分析，确认共有色谱峰17个，采用中位数法生成对照图谱，结果见图1-3。通过与对照品的保留时间和紫外吸收峰对比，指认出1号峰为没食子酸，12号峰为鞣花酸，见图4。

图1 15批玫瑰花传统饮片的指纹图谱Fig.1 Fingerprints of 15 batches of decoction pieces of Rosae Rugosae Flos

图2 15批玫瑰花破壁粉体的指纹图谱Fig.2 Fingerprints of 15 batches of ultrafine powder of Rosae Rugosae Flos

图3 35批玫瑰花破壁饮片的指纹图谱Fig.3 Fingerprints of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

图4 色谱峰的指认Fig.4 Identification of chromatographic peaks

2.5 玫瑰花传统饮片-破壁粉体-破壁饮片化学成分的相关性分析

采用上述相似度评价系统，分别计算15批玫瑰花传统饮片、15批破壁粉体、35批破壁饮片的相似度及同批次玫瑰花由传统饮片到破壁粉体再制成破壁饮片之间的相似度，并生成3种状态饮片各自的对照指纹图谱、计算其相似度。结果表明15批玫瑰花传统饮片（原料）之间的相似度均大于0.99，15批玫瑰花破壁粉体（ 中间品）之间的相似度均大于0.98，35批玫瑰花破壁饮片（成品）之间的相似度均大于0.98。各批次玫瑰花由传统饮片到破壁粉体再制成破壁饮片三者之间的相似度均大于0.99，见表3。玫瑰花传统饮片、破壁粉体和破壁饮片分别生成的共有模式非常相似，如图5、表4所示三者的相似度大于0.99。上述结果表明，来自同一主产地的玫瑰花药材化学成分物质基础相较一致，玫瑰花由传统饮片制成破壁饮片时，只是外观形态发生改变，各主要化学成分均较一致，物质基础传递好，制备工艺稳定。

表3 15批次玫瑰花传统饮片-破壁粉体-破壁饮片间的相似度Tab. 3 Similarity among the 15 batches of decoction pieces-ultrafine powder-ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

表4 共有模式相似度结果Tab. 4 Similarity results of shared pattern

图5 15批玫瑰花传统饮片-15批破壁粉体-35批破壁饮片共有模式比较Fig.5 Shared mode comparison among the 15 batches of decoction pieces of Rosae Rugosae Flos-15 batches ultrafine powder of Rosae Rugosae Flos-35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

2.6 35批玫瑰花破壁饮片聚类分析和主成分分析

运用SPSS 26.0和SIMCA 14.1软件对35批玫瑰花破壁饮片样品进行聚类分析和主成分分析。以17个共有峰的峰面积为变量，采用Ward联结法，选用Z得分对数据进行标准化，以平方欧式距离测量进行系统聚类，分析结果见图6，结果显示，当平方欧式距离为15时，35批样品被分为2类，其中UGP1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14聚为一类，其全部为小试工艺制成的玫瑰花破壁饮片。UGP8、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35归为一类，除UGP8、13、15外，其余全是大生产玫瑰花破壁饮片。以17个共有峰的峰面积为变量进行PCA分析，结果显示，2个主成分的累计贡献率达到73.4%。从PCA得分图显示35批玫瑰花破壁饮片可大致分为两类，其中12批小试破壁饮片分为一类（除UGP7、13、15），20批大生产破壁饮片分为一类，与聚类分析的结果基本相一致，得分图见图7。为进一步确认造成分类差异的因素对其进行OPLS-DA分析，分析结果见图8，从中更可以直观的看出将35批破壁饮片分为两类，提取OPLS-DA模型中变量的VIP图，分析结果见图9，对17个共有峰的峰面积进行VIP排序，显示17号峰（VIP 1.611 67），5号峰（VIP 1.567 39），10号峰（VIP 1.374 4），11号峰（VIP 1.287 63），4号峰（VIP1.179 83），2号 峰（VIP 1.063 78），3号 峰（VIP 1.031 43），9号峰（VIP 1.028 15）的VIPpred值均大于1，说明以上这些化学成分是造成15批小试制备破壁饮片和20批大生产破壁饮片分类的主要差异性成分。

图6 35批玫瑰花破壁饮片HCA图Fig.6 HCA of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

图7 35批玫瑰花破壁饮片PCA-X得分图Fig.7 PCA-X scores of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

图8 35批玫瑰花破壁饮片OPLS-DA得分图Fig.8 OPLS-DA scores of 35 batches of ultrafine granular powder of Rosae Rugosae Flos

图9 差异标志物的VIP得分图Fig.9 VIP scores of different markers

3 讨论

在供试品的制备方法优化中，考察了提取时间（30、45、60 min）、提取方式（超声、加热回流和索氏提取）、提取溶剂（乙醇和50%、70%、80%、100%甲醇）以及料液比（0.5 g∶25 mL、0.5 g∶50 mL、1 g∶25 mL、1 g∶50 mL）对提取效率的影响，确定了最终的供试品溶液制备方法。

在色谱条件的优化中，分别考察了不同检测波长（254、280、300 nm）、流动相系统（乙腈/甲醇-水；乙腈/甲醇-0.1%冰醋酸水溶液；乙腈/甲醇-0.1%甲酸水溶液；乙腈/甲醇-0.1%磷酸水溶液）并进行梯度优化，考察不同柱温（20、25、30、35、40℃）、流 速（0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2 mL/min）、进样体积（5、10、15、20 μL）的影响，根据色谱峰峰形、分离情况等确定上述最佳色谱条件。

本研究通过计算相似度对比分析65批玫瑰花样品的HPLC指纹图谱，结果提示，玫瑰花传统饮片与破壁饮片和粉体之间具有极高的相似度，表明玫瑰花破壁饮片由玫瑰花传统饮片到破壁粉体再到制粒，只是物理形态发生改变，三者之间的化学成分种类基本没有新增和减少，整体概貌未改变，具有同质性。且15批收集的玫瑰花样品在同一地区不同区域之间的相似度大于0.99，表明同一主产地的玫瑰花样品之间的物质基础相一致。通过聚类分析和主成分分析对不同工艺的玫瑰花破壁饮片样品进行分析，聚类结果和PCA分析得分图显示35批玫瑰花破壁饮片样品大致分为两类，可见不同工艺制备的玫瑰花破壁饮片之间存在差异性。进而通过SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别分析，其得分图明显显示35批样品分为两类，其中小试一类，大生产一类，通过VIP预测找到主要影响分类的因素，结果表明峰17、5、10、11、4、2、3、9是造成分类的主要因素。说明大生产与小试工艺制成的玫瑰花破壁饮片存在差异，主要表现在峰17、5、10、11、4、2、3、9上。由于本实验没有进行上述成分的指认，因此后续需要进一步进行上述成分的指认及含量测定并考察不同工艺对这些化学成分的影响。

4 结论

本研究所建立的玫瑰花破壁饮片HPLC指纹图谱方法，确定了17个共有峰，指认了2个化学成分（没食子酸、鞣花酸）。该方法具有良好的重复性、精密度及稳定性，可用于评价玫瑰花传统饮片到破壁粉体再制成破壁饮片三者之间的物质基础是否发生改变以及生产工艺的稳定性，可为玫瑰花破壁饮片的质量控制提供参考，后续研究可进一步在本研究的基础上结合LC-MS和GC-MS等多种手段对玫瑰花破壁饮片指纹图谱中的化学成分进行指认。