赤芍对缺血性脑卒中大鼠PGC-1α/Nrf2通路促血管新生作用研究

陈敏纯，闫抗抗，曹 青，谷建俐，郑 洁，刘生元

（西北大学附属医院/西安市第三医院 药剂科，陕西 西安710018）

缺血性脑卒中严重危害人类健康，其致病率、死亡率居全球首位[1]。缺血是缺血性脑卒中损伤的始动因素。“治疗性血管新生”成为国内外治疗缺血性脑卒中的研究热点[2]。血管新生为缺血性脑卒中的神经发生、突出再生、神经功能恢复提供氧气、供应营养物质，以及提供生长因子[3]。研究发现PGC-1α/Nrf2是挽救脑细胞，恢复神经功能的潜在靶点，PGC-1α/Nrf2通路是参与内皮细胞形成血管的关键性靶点，其调控血管新生所累及多种因子表达[4-5]。临床以赤芍为主要组成的中药复方制剂和中成药有数百种（如：补阳还五汤、通窍活血汤、步长脑心通胶囊、脑血栓片等），这些药物治疗缺血性脑卒中应用广泛且疗效确切，充分证实赤芍脑保护作用。贾所学在《药品化义》中记载“红花为血中气药，能泻又能补，佐赤芍治遍身血气刺痛，此其行导而活血也”。现代药理学研究证明赤芍可改善脑组织线粒体酶活性，缓解脑能量代谢障碍，改善大鼠脑梗死面积，减少神经元细胞凋亡[6-7]。赤芍对脑缺血损伤有保护作用，但其改善脑缺血与促进脑血管新生的相关性及分子作用机制，鲜有报道。本研究以大鼠缺血性脑卒中为模型，考察赤芍调控PGC-1α/Nrf2信号通路促血管新生作用，为中医药防治缺血性疾病提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器、药品及试剂

Cyto FLEX型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；RM 2016型病理切片机（德国莱卡公司）；BX53型显微镜（日本奥林巴斯公司）；HI650型冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Multiskan MK3型全自动酶标仪（美国赛默飞科技公司）；JY-SCZ2+型电泳仪及170-4070转膜仪（美国Bio Rad公司）。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（美国Roche Applied Science公司，批号：12156792910）；抗荧光淬灭封片剂（美国Southern Biotech公司，批号：0100-01）；DAPI（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C1002）；CD34（美国Abcam公司，批号：ab81289）；PGC-1α抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66369-1-Ig）；Nrf2抗体（美国Affinity公司，批号：AF0639）；VEGF抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：19003-1-AP）；VEGFR-2抗体（美国Abcam公司，批号：ab45010）；赤芍（陕西兴盛德药业有限责任公司，批号：20191201）。

1.2 动物

8 ～ 10周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量为180 ～ 220 g，购于三峡大学实验动物中心。大鼠进行适应性饲养1周后才开始试验。

2 试验方法

2.1 分组、给药、造模

分组：将40只大鼠分为空白对照组、模型组、赤芍低剂量组（200 mg/kg）、赤芍中剂量组（350 mg/kg）、赤芍高剂量组（500 mg/kg），共5组，每组8只。赤芍制剂制备按《标准化煎药中心基本要求》（SCM02-2018）的制作方法，将赤芍按剂量煎煮制成汤剂，采用喷雾干燥技术将汤剂制成细颗粒，用生理盐水溶解灌胃。给药剂量基于预实验和以往文献数据[8]赤芍0.5 g/kg。大鼠缺血性脑卒中模型建立：用尼龙线线栓法制备大鼠大脑右侧颈内动脉阻闭模型，在颈正中切开小口，结扎颈总动脉和颈内外动脉，在颈总动脉分叉下方剪开小口，置入线栓。缺血2 h后拔除线栓。空白对照组和模型组给予生理盐水灌胃，给药组每天给予赤芍一次，连续灌胃7 d。

2.2 神经功能评分

给药结束后，进行Garcia评分，根据自主运动情况，碰触胡须反应情况，大鼠悬空状态时四肢活动对称情况，大鼠攀爬能力及抓握铁网能力，前爪伸展情况，碰触大鼠身体其感觉反应情况等，按照大鼠反应程度进行1、2、3分评定，分数越高，意味着大鼠神经功能越完善。

2.3 脑梗死体积检测

大鼠神经功能评分后，用水合氯醛（100 mg/kg）进行腹腔注射，取大脑，沿冠状面进行切片，约2 mm厚度，浸泡于2% TTC溶液中，孵育30 min后用10%的多聚甲醛固定2 h，呈现红色为非梗死区域，呈现白色为梗死区域。计算脑梗死体积。

2.4 脑组织病理学观察

大鼠脑组织块用10%的多聚甲醛固定2 h后，用不同浓度的乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋及切片处理，用苏木精碱性染料将细胞核染成蓝紫色，1%伊红酸性染液将细胞质染成红色。照相倍数为200倍。

2.5 TUNEL凋亡检测

大鼠脑组织切片用二甲苯、乙醇、PBS进行预处理，滴加蛋白酶K工作液反应30 min，目的是去除组织蛋白。然后加入2% H2O2孵育5 min，用PBS洗涤3次，滴加TdT酶反应混合液，于37 ℃中避光孵育1 h，再对标本进行染核，滴加DAPI避光孵育5 min。荧光显微镜下观察组织切片，呈红色荧光为凋亡细胞，呈蓝色荧光为细胞核。照相倍数为400倍。

2.6 大鼠脑微血管密度

将大鼠脑组织石蜡切片进行脱蜡，抗原修复10 min，加入3% H2O2溶液孵育15 min，阻断内源性过氧化酶，再滴加1∶400 CD34溶液孵育15 h，PBS清洗3次，滴加HRP标记的山羊抗兔/小鼠二抗，于37 ℃中孵育20 min后，加入显色剂显色，用苏木素复染1 min后脱水封片。照相倍数为400倍。

2.7 脑 组 织 中PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表达检测

提取脑组织蛋白并对蛋白浓度进行定量计算。配制电泳胶，用移液枪将制备好的蛋白样品和MAKER滴加到电泳胶上，各分析样品总蛋白量为40 μg，在恒压120 V下进行电泳分离后，取出凝胶并切下目的条带，进行转膜。用含5%脱脂奶粉TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，在室温环境中的摇床仪器上封闭2 h。将PVDF膜浸泡于一抗孵育液中（一抗稀释液比例PGC-1α为1∶2 000、Nrf2为1∶500、VEGF为1∶500、VEGFR-2为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，再次将PVDF膜浸泡于HRP标记二抗的孵育液中，37℃摇床孵育2 h。显色曝光，用BandScan分析胶片灰度值。

2.8 统计学方法

用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P< 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 神经功能评分

空白对照组大鼠神经功能正常，模型组神经功能受损最严重。与空白对照组比较，模型组评分降低（P< 0.05），表明模型制备成功。给药组神经功能明显改善，与模型组比较，赤芍低、中、高剂量组评分均降低（P< 0.05），且呈剂量依赖性，见表1。

表1 大鼠神经功能评分±s，n = 8）Tab. 1 Effects of paeoniae on neurological sore in model rats±s，n = 8）

表1 大鼠神经功能评分±s，n = 8）Tab. 1 Effects of paeoniae on neurological sore in model rats±s，n = 8）

注：与空白对照组比较，＃P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05。

组别 神经功能评分空白对照组 18.00 ± 0.00模型组 6.12 ± 0.35＃赤芍低剂量组 7.75 ± 0.36*赤芍中剂量组 9.75 ± 0.53*赤芍高剂量组 11.50 ± 0.46*F 141.149 P 0.000

3.2 脑梗死体积

空白对照组大鼠脑组织形态正常，无梗死体积，模型组大脑梗死体积最大（37.38 ±1.62）%，而给药组脑梗死体积与模型组比较，梗死体积变小（P<0.05），且呈剂量依赖性，高剂量组脑梗死灶最小（22.26 ± 0.65）%。说明赤芍改善缺血性脑卒中大鼠脑神经功能，缩小脑梗死灶，见图1。

图1 大鼠脑梗死体积（n = 8）Fig.1 Effects of paeoniae on cerebral infarct volume in model rats（ n = 8）

3.3 脑组织病理学变化

HE染色显示空白对照组神经元细胞数量多，排列整齐，形态基本正常，胞核位于细胞中央；模型组脑组织疏松，神经元细胞排列紊乱，胞核固缩，颜色深染。给药组的脑组织形态明显恢复，胞核固缩较模型组程度低，神经元正常结构消失但大体形态存在。证实给药组脑组织病理学改善明显，赤芍对缺血性脑卒中大鼠有治疗作用，见图2。

图2 大鼠脑组织病理学变化（×200）Fig.2 Effects of paeoniae on the pathological changes in the brain tissue of model rats（ ×200）

3.4 TUNEL检测细胞凋亡情况

空白对照组无TUNEL阳性细胞，而模型组细胞凋亡数量最多（47.58 ± 3.51）%。与模型组比较，给药组TUNEL阳性细胞降低（P< 0.05），且呈剂量依赖型，高剂量组细胞凋亡数最少（29.32 ± 2.65）%，见图3。

图3 赤芍对模型大鼠抗细胞凋亡影响（n = 8）Fig.3 Effects of paeoniae on anti-apoptosis in model rats（n = 8）

3.5 大鼠脑血管新生的影响

空白对照组大鼠脑组织血管丰富，与空白对照组比较，模型组CD34表达降低，新生血管减少（P<0.05）；与模型组比较，给药组CD34表达水平明显升高（P< 0.05），且呈剂量依赖型，见图4。

图4 赤芍对模型大鼠脑组织血管新生的影响（×400）Fig.4 Effects of paeoniae on angiogenesis in the brain tissue of model rats（×400）

3.6 脑 组 织 中PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表达蛋白表达影响

与空白对照组比较，模型组PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表达增加（P< 0.05）；与模型组比较，给药组PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表达明显增加（P< 0.05），见图5。

图5 赤芍对模型大鼠PGC-1α、Nrf2、VEGF、VEGFR-2蛋白表达影响（n = 8）Fig.5 Effects of paeoniae on the expression of PGC-1α，Nrf2，VEGF and VEGFR-2 in the brain tissue of model rats（n = 8）

4 讨论

“治疗性血管新生”与中医学的“益气生脉”“活血生肌”理论密切相关。缺血性脑卒中可归为中医血瘀证“血脉瘀阻”，而“活血生肌”是中医治疗脑缺血的主要治法。赤芍有破血行气、清热解毒、引血下行之功效。通过对中医药治疗缺血性脑卒中的用药规律统计分析发现，单味中药用药频次赤芍位居第六[9]。辨证为气虚血瘀证、痰湿阻络证、风痰痹阻证、颅脑水瘀证中，赤芍使用频率分别为52.01%、48.43%、45.93%、32.65%[10]。现代药理学研究发现赤芍改善脑缺血梗死面积，增加SOD、CAT和GSH-Px活性，降低血清MDA和LPO水平；上调Bax水平和下调Bcl-2水平，发挥抗凋亡损伤[11]。前期研究证实赤芍中的多酚类活性物质鞣花酸具有血管内皮保护作用，且发现对Nrf2有诱导作用[12]。因而推测，赤芍可激活Nrf2信号通路促进血管新生，发挥脑保护作用。

本研究显示赤芍缩小脑组织梗死灶，缓解病理损伤，减少神经元细胞凋亡，对缺血性脑卒中大鼠有保护作用。赤芍是否通过促血管新生发挥脑保护作用，需进一步进行缺血灶微血管密度及血管内皮生长因子（VEGF）表达水平的检测。免疫组化结果显示空白对照组CD34仅有少量黄褐色沉淀。与空白对照组比较，模型组CD34表达上升。CD34蛋白是新生血管增殖的标志物，在正常情况下为少量表达，脑缺血后，CD34表达增多，则提示脑缺血刺激CD34表达，促血管新生。给药组高于模型组（P< 0.05），表明赤芍上调CD34表达，增加大鼠缺血灶微血管密度。VEGF是一种内源性血管生长因子，在血管生成的各个阶段均发挥着重要作用[13]。VEGFR-2是VEGF的受体，作用于血管内皮细胞，两者结合激活血管新生效应。本实验显示，与模型组比较，给药组增加脑组织VEGF、VEGFR-2表达，提示赤芍上调VEGF、VEGFR-2等细胞因子表达，增加缺血周围组织的微血管密度，促进缺血区域循环的建立。

PGC-1α是调控内皮细胞凋亡的重要因子，动员VEGF参与新生血管形成，改善神经和内皮损伤[14]。Nrf2是维持内皮细胞的形态和保持血管功能完整性的重要因子[15]。现代研究表明，Nrf2激活可促进血管内皮细胞的出芽生长，增加深层毛细血管数量，在血管新生过程中发挥效应。本实验结果显示，与空白对照组比较，模型组PGC-1α表达增加（P< 0.05）。此结果与以往研究结果一致，研究证明PGC-1α有神经保护作用[16]，脑缺血损伤则上调PGC-1α表达，而抑制PGC-1α表达则加重脑损伤。与模型组比较，给药组PGC-1α、Nrf2蛋白表达显著上调，提示赤芍促血管新生作用通过激活PGC-1α/Nrf2信号通路诱导VEGF/VEGFR-2高表达。

5 结论

本实验研究了赤芍激活PGC-1α/Nrf2信号通路促血管新生发挥脑保护作用，为其临床应用提供一定的理论依据。同时，阐明赤芍“活血生肌”抗缺血性脑卒中的科学内涵，为中医药防治缺血性脑卒中提供一定的试验依据。本实验尚需应用PGC-1α-/-或Nrf2-/-模式动物，验证PGC-1α与Nrf2和VEGF的关系及促血管新生的作用。