消癥散结栓对大鼠细菌性阴道炎的治疗作用与机制研究

2021-09-15吕邵娃黄雨婷刘玉甜郭玉岩李永吉

现代中药研究与实践 2021年4期

吕邵娃，黄雨婷，刘玉甜，郭玉岩，周金，李永吉*

（1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040； 2.黑龙江鹤翔制药有限责任公司，黑龙江齐齐哈尔 161000）

细菌性阴道炎（bacterial vaginosis，以下简称BV）疾病的对象多为已婚女性，是临床常见的一种妇科疾病，中医学的研究重点领域一般认为，BV的临床致病性和危害范围属“阴痒”“带下病”[1]。其主要病因是“湿”邪侵入机体，或肝经湿热侵袭下体，或由湿腐生虫、虫邪直犯阴器所导致。根据女性生理结构的特殊性，常用外治法治疗BV，独特性在于促使药物直达病灶，发挥药效，抑制毒邪生长，加快机体肠黏膜对药物的吸收[2-3]。同抗生素类药物对比，中药制剂无明显的耐药性。散结乳癖消贴膏（国药准字：Z20040073）是由莪术、姜黄、白芷、急性子、天葵子、木鳖子6味中药组成，具有行气活血、散结消肿的作用，用于气滞血瘀所致的乳癖。临床使用发现其可以有效地抑制引起感染的致病菌[4]，如白色念珠菌等其它相关致病菌。本实验所用药物为消癥散结栓，是经过中医辨证论治对散结乳癖消贴膏的二次开发[5]，在原处方的基础上，增加了一味藤黄药材，藤黄具有消肿、攻毒、祛腐敛疮、杀虫的功效，此新型栓剂拟用于治疗具有炎症反应的阴道感染性疾病。本实验采用金黄色葡萄球菌-白色念珠菌混合液建立BV大鼠模型，通过考察消癥散结栓改善大鼠BV 的功效及相关病理学分析，来验证消癥散结栓对BV大鼠的治疗作用，为临床治疗 BV 提供新型药物。

1 材料

1.1 实验动物

雌性SD大鼠60只，清洁级，体质量为200 ～260 g，购于青岛大任实验动物有限公司，许可证编号：SCXK（辽）2015-0001。动物实验经黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会批准（编号：RL15008）。

1.2 实验试剂

消癥散结栓（自制）；消糜栓（批号：Z20025663，通化万通药业有限公司）；苯甲酸雌二醇（批号：20160101，天津必佳药业集团有限公司）；金黄色葡萄球菌（BNCC 186335）、白色念珠菌（BNCC 186382）、前列腺素2（PGE2）、前列腺素 2α（PGF2α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）均购自于上海江莱生物有限公司；PBS液（美国康宁公司）；ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器

Labo LB-2004型电子分析天平（蓝博惠科有限公司）；CKX31-A12PHP型倒置显微镜（日本Olympus公司）；SB-5200D型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BJ-2CD型垂直净化工作台（上海博讯仪器有限公司）；ZHP-100型恒温振荡培养箱（上海精其仪器有限公司）。

2 方法

2.1 BV 小鼠模型制备

配制浓度为0.5麦氏浓度的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌悬液。按1∶1的比例进行混合，配制成感染菌液。取自然状态下健康的雌性大鼠，于第1、3和5天对大鼠皮下注射10 mg/kg的苯甲酸雌二醇注射液。无菌缓冲液清洗大鼠阴道3次后吸取适量的混合菌液，轻缓的插入大鼠阴道约1 ～ 1.5 cm处，每日接菌量为0.5 mL/kg, 连续7 d。菌株接种后，每日观察大鼠阴道变化情况。当大鼠阴道外观出现明显充血、发红、变肿且有大量白色黏性分泌物时，取分泌物进行涂板观察及培养，在显微镜下观察，可见大量的坏死细胞和细菌，平板内大量菌株生长旺盛，表明大鼠阴道的环境已被菌株破坏，大鼠BV模型建立成功。

2.2 实验分组及给药方法

按照“2.1”项下方法，向阴道注入细菌7 d后全部呈现阴道炎症状，表明造模成功。将模型大鼠随机分为6组，每组10只，即空白组、模型组、消癥散结栓高剂量组、消癥散结栓中剂量组、消癥散结栓低剂量组以及阳性药组。除空白组及模型组不予处理外，消癥散结栓高、中、低剂量组分别按200、100、50 mg/kg的剂量给药。阳性药组则以消糜栓100 mg/kg阴道给药。连续给药14 d，于末次给药24 h后，磷酸盐缓冲液充分的灌洗大鼠阴道，收集灌洗液于无菌管中。次日处死大鼠，将大鼠阴道及子宫等组织进行剥离保存，用于检测炎症因子含量及相关病理学检查。

2.3 ELISA 法检测小鼠阴道分泌物中炎症因子

用无菌胶头滴管吸取适量PBS缓冲液，伸入雌鼠阴道内，收集各实验组的大鼠的阴道灌洗液。剪取大鼠子宫组织，经研磨、裂解、匀浆、离心，取上清液，相关处理后，按试剂盒说明进行操作。

2.4 HE染色考察大鼠阴道组织病变程度

取大鼠部分阴道组织，浸泡于10%的甲醛溶液中固定，经脱水、透明、浸蜡、切片（4 μm），HE染色后，置于显微镜下，进行大鼠阴道组织的病理学分析。

2.5 统计学方法

用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对BV大鼠阴道口外观的影响

与空白组比较，模型组大鼠阴道口处发红、肿胀，可见白色黏性的阴道分泌物，少数出现糜烂现象；消癥散结栓的高、中剂量组及阳性药组的大鼠外阴均恢复正常的外观。阴道粘膜光滑,无溃病及糜烂,结构清楚。消癥散结栓的低剂量组阴道外观有轻度充血、红肿,有少量脓性分泌物。

3.2 BV大鼠模型的阴道组织切片HE染色

通过HE 染色进行病理学检查，结果表明, 空白组黏膜上皮光滑、无坏死组织脱落、固有层为致密结缔组织，未见充血水肿及炎细胞浸润；模型组阴道壁变厚，上皮细胞坏死，固有层出现充血和水肿，以中性粒细胞为主，淋巴细胞和单核细胞炎细胞浸润，纤维细胞增生明显，说明该模型造模成功；与模型组比较，消癥散结栓高、中、低剂量组、阳性药组病理组织切片中，中性粒细胞浸润均不同程度减少，阴道黏膜上皮细胞不同程度增厚，尤其是消癥散结栓高、中剂量组阴道组织切片中黏膜完整、粘膜下组织基本恢复正常。结果见图1。

图1 各组阴道组织的HE染色结果比较（200×）Fig.1 Comparison of HE staining results of vaginal tissue in each group（200×）

3.3 消癥散结栓对BV大鼠阴道中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子分泌的影响

用ELISA 法检测大鼠阴道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，结果显示，与空白组比较，模型组的TNF-α、IL-6以及IL-1β水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，消癥散结栓各剂量组的TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显降低（P＜0.05），且消癥散结栓高剂量组作用更加明显，消癥散结栓中、高剂量组优于阳性药组，结果见表1。

表1 消癥散结栓对BV大鼠阴道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响±s，n = 5）Tab. 1 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in vaginal secretions of BV rats±s，n = 5）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，#P＜0.05,##P＜0.01。

空组白别组（剂mg-量/k g/）2.8 T9N±F 0-.α 0 4** 2.74 I L±-0 6.4 5** 3.1 I2L±- 10β.28*模型组 - 3.85 ± 0.43## 4.39 ± 0.64## 3.72 ± 0.33#消癥散结栓50 3.19 ± 0.23*# 2.85 ± 0.13** 3.16 ± 0.16**低剂量组消癥散结栓100 2.89 ± 0.11** 2.66 ± 0.41** 2.98 ± 0.33**中剂量组消癥散结栓200 2.81 ± 0.26** 2.32 ± 0.47** 2.91 ± 0.18**高剂量组阳性药组 100 3.02 ± 0.01**## 2.74 ± 0.14** 2.84 ± 0.19**#F 16.878 18.227 5.247 P 0.000 0.000 0.001

3.4 消癥散结栓对BV大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β炎症因子分泌的影响

用ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β水平，结果显示，模型组的TNF-α、PGE2α及IL-1β水平高于空白组（P＜0.05）；消癥散结栓各剂量组的TNF-α、PGE2α、IL-1β水平低于模型组（P＜0.05），且消癥散结栓高剂量组作用明显，优于阳性药组，结果见表2。

表2 消癥散结栓对BV 大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β及水平的影响±s，n = 5）Tab. 2 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on serum levels of TNF-α, PGE2α and IL-1β in BV rats±s，n = 5）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，#P< 0.05，##P < 0.01。

组别（剂mg量/kg/） TNF-α PGE2α IL-1β空白组 - 2.07 ± 0.24** 1.94 ± 0.07* 1.81 ± 0.04*模型组 - 4.11 ± 0.65## 3.12 ± 0.96# 2.75 ± 0.90#消癥散结栓50 1.92 ± 0.12** 2.07 ± 0.33* 1.81 ± 0.12*消低癥剂散量结组栓100 1.88 ± 0.19** 1.98 ± 0.33* 1.74 ± 0.21*消中癥剂散量结组栓200 1.35 ± 0.58**# 1.91 ± 0.25** 1.69 ± 0.20**高阳剂性量药组组 100 1.86 ± 0.11**# 1.94 ± 0.14**## 1.72 ± 0.11*F 37.661 5.247 9.360 P 0.000 0.001 0.000

3.5 消癥散结栓对BV 大鼠子宫组织中PGF2α及PGE2水平的影响

模型组的PGE2、PGE2α水平高于空白组（P＜0.05）；消癥散结栓各剂量组的PGE2、PGE2α水平低于模型组（P＜0.05），但弱于阳性药组。结果见表3。

表3 消癥散结栓对BV 大鼠子宫PGE2、PGE2α水平的影响±s，n = 5）Tab. 3 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on PGE2 and PGE2α levels in uterus of BV rats±s，n = 5）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，#P< 0.05，##P< 0.01。

组别剂量/（mg/kg） PGE2 PGE2α空白组 - 3.09 ± 0.38** 3.22 ± 0.29**模型组 - 4.76 ± 0.60## 3.88 ± 0.32##消癥散结栓50 3.70 ± 0.29**## 3.39 ± 0.32*低剂量组消癥散结栓100 3.31 ± 0.09** 3.28 ± 0.13**中剂量组消癥散结栓200 3.21 ± 0.26** 3.22 ± 0.22**高剂量组阳性药组 100 3.01 ± 0.31** 3.35 ± 0.15**F 20.016 7.534 P 0.000 0.000

4 讨论

女性阴道黏膜极易受到各种有害细菌的直接侵害导致感染[6-8]。其病因复杂，多种因素均可导致炎症发生。患者病症反复，病程较长，不易根除。临床研究发现，BV患者的阴道分泌物中可检查到致病菌的存在，同时在患者的阴道组织中有数目较大的炎症因子存在[9]。通过对炎症因子的检测发现，常见的致病因子其中包括 TNF-α，还有白介素类，如IL-6、IL-1β，其中 TNF-α在患者感染初期便可以被检查到，且大量存在。当TNF-α、IL-1β及IL-6大量存在时，可诱导机体前列腺素的分泌，典型的为PGE2与 PGF2α。大量的炎症黏附因子主要存在于炎症细胞机体，其大量存在使组织器官受损[10]。本实验主要探讨了中药复方消癥散结栓对抗细菌性阴道炎的作用及机制。

本实验所采用的药物消癥散结栓是由藤黄、莪术、姜黄、白芷、急性子、天葵子、木鳖子7味中药经粉碎后，与适量蜂蜜混合进行发酵，后与适宜的基质混合而组成的复方制剂。方中君药为藤黄，现代药理学研究表明，藤黄具有广谱抗菌作用，其活性可以抑制真菌及病原虫的生长及繁殖[11]。姜黄的药理作用表现在杀菌、抗炎等，其在治疗癌症方面也有所应用。同时姜黄可以提高机体的免疫能力，对抗疾病的发生[12]。莪术及白芷均具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗病毒等作用。相关研究证实，急性子有效部位的提取物可以通过抑制相关蛋白的表达，同时诱导细胞凋亡，从而对前列腺癌细胞的生长起到抑制作用[13]。天葵子善清热解毒、消肿散结、利水通淋，现代医学常用作预防和治疗女性卵巢癌等疾病。木鳖子的现代研究甚少，其研究现状大多为木鳖子的抗肿瘤及对癌症的治疗，其有效成分皂苷对白色念珠菌及其它真菌具有显著的抑制作用。全方配伍，药少力专，有消癥散结、活血通经、行气止痛之功效，适用于癥瘕积聚、气滞血瘀证。同时本药在抑菌方面的显著成效为新制剂的研究奠定了基础[14]。

体内实验结果显示，在给予BV模型大鼠消癥散结栓治疗后，对比空白组与模型组间大鼠血清的相关数据，模型组的TNF-α、PGE2α及IL-1β水平显著升高，对比模型组与各给药组之间的相关数据发现，其中各给药组中的TNF-α、PGE2α、IL-1β水平显著降低，各给药组的大鼠子宫组织中， PGE2、PGF2α含量水平较模型组显著减少。表明消癥散结栓可减少 PGF2α、PGE2水平，通过减少其表达来抑制前列腺素的分泌。多次给药证实消癥散结栓对大鼠阴道组织无刺激性作用。通过对大鼠阴道口外观的观察及阴道组织切片病理学检验表明消癥散结栓能抗金黄色葡萄球菌、白色念珠菌感染引起的大鼠细菌性阴道炎。

5 结论

消癥散结栓对BV模型大鼠的疾病症状具有明显的治疗作用，其作用机制可能是通过抑制BV模型大鼠阴道内的炎症因子的释放从而减少 PGF2α、PGE2水平，减少其表达来抑制前列腺素的分泌从而缓解BV的炎症反应。因此，消癥散结栓对细菌性阴道炎治疗具有一定应用价值。本实验为治疗女性阴道感染等疾病的新药研制提供了重要的参考。