石菖蒲挥发油成分对正常SD乳鼠心肌细胞活力的影响*

程莉， 蒲秋易 ，左冠超

(1.成都市中西医结合医院 中药剂科， 四川 成都 610095； 2.成都中医药大学附属四川省康复医院 & 四川省八一康复中心 中西医结合科， 四川 成都 610000)

石菖蒲属天南星科植物，其根状茎有气味，叶全缘，两排排列，肉质圆锥花序，花梗绿色，刀叉状。石菖蒲生长在海拔较高的地区，大多在山涧溪流水石缝隙或沟谷水与碎石之间，石菖蒲根茎常被用作药材，具有化湿开胃、开窍豁痰、醒神益智的功效[1]。石菖蒲主要有效成分为挥发油，包括β-细辛醚、α-细辛醚及甲基异丁香酚等成分，其中β-细辛醚、α-细辛醚具有保护神经、镇静及催眠的作用，临床常用于治疗老年痴呆、癫痫及抑郁症[2]。中药挥发油提取方法有蒸气蒸馏、溶剂萃取、压榨、微波萃取、超声波提取及超临界流体萃取法等，水蒸气蒸馏法由于设备简单、操作简单、成本低，是常用的挥发油提取方法[3]，但该法在提取过程中存在乳化、油水分离困难等问题，导致挥发油提取率低且质量差，因此从化学成分的角度探索挥发油的乳化机理，可为开发挥发油破乳技术提供理论依据、亦可提高挥发油的品质[4]。气质联用法(gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS)法是将气相色谱和质谱仪结合并借助计算机进行分析，具有GC的高分辨率和MS的高灵敏度，能够同时获取样品成分种类和含量分布信息，并以图像的形式反映分布情况[5-6]。本研究采用GC-MS法分析鉴定石菖蒲挥发油中各种成分的含量，并观察其对正常大鼠心肌细胞活力的影响，对石菖蒲进一步开发利用和质量评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1主要仪器 使用美国安捷伦公司的Agilent 7890A/5975C型GC-MS，色谱柱为DB-5石英毛细管管柱，西安常仪仪器设备有限公司供应的MH-1000型1 000 mL可调式电热套，徐州江煤科技有限公司发布的供应的TG328A型万分之一电子天平。

1.1.2主要材料 石菖蒲饮片(安徽新兴中药材饮片有限公司)，经鉴定为天南星科植物石菖蒲Acorus Tatarinowii Schott的干燥根茎；甲醇(美国Sigma Aldrich，)，无水Na2SO4(沈阳永恒运化工原料有限公司)，其他试剂为分析纯。

1.2 研究方法

1.2.1挥发油制备 根据《中国药典》中方法[7]，取石菖蒲药材200 g粉碎过目筛，加水500 mL于1 000 mL电热套中，提取4 h，取精油0.1 mL将挥发油反复溶出，并采用无水Na2SO4过夜后经0.45 μm微孔滤膜滤过装入样品瓶中密封保存。

1.2.2溶液制备 (1)内标溶液：将十四醇、二十二烷溶解后装于测量瓶中，然后调整规模获得质量浓度2 g/L十四醇溶液和22 g/L二十二烷溶液。(2)供试品溶液：取“1.2.1”项下挥发油油1～12支，用无水乙醇溶解，装入10 mL量瓶中，转移1～100 mL的量瓶中，加入蒸馏水定容，然后转移5～20 mL顶空取样瓶中，并各加入50 μL的十四醇和二十二烷内标溶液，压盖密封，得到挥发油试验溶液。

1.2.3色谱条件 石英毛细管管柱(0.25 mm×0.25 μm×60 mm)，柱流量1.0 mL/min，载气为氦气，汽化室温度为250 ℃。升温顺序：温柱90 ℃、保持1 min，以3 ℃/min速率升至120 ℃，然后以2 ℃/min速率升至140 ℃，保持3 min、以5 ℃/min速率升至190 ℃，最后以10 ℃/min速率升至260 ℃、保持2 min。分流比为50 ∶1，进样量为1.0 μL。

1.2.4质谱条件 电离方式：电子轰击(EI)，电子能量70 eV，离子源温度280 ℃，四级杆温150 ℃，接口温度280 ℃，扫描范围20～550 m/z，扫描时间 200 ms。

1.2.5大鼠心肌细胞培养 取出生24 h内的SD乳鼠，麻醉处死，75%的酒精消毒后取出心脏，用预冷PBS缓冲液清洗3次，剪成块状放入小瓶子中并加入0.25%胰蛋白酶，4 ℃放置16 h取出后去除胰酶，然后加入0.25%胰酶，37 ℃放置20 min，并加入含10%新生牛血清的DMEM培养基终止消化。使用100目钢筛过滤细胞悬液后收集于离心管中，离心去上清后沉淀细胞加入含10%新生牛血清的DMEM培养基，接种于培养瓶中，置37 ℃的培养箱中培养2 h后，按差速贴壁分离法纯化细胞，然后接种于培养板并于培养箱中培养，每24 h换1次培养液培养3～5 d。

1.2.6细胞活力检测 采用MTT法测定细胞存活率：将心肌细胞悬液接种到96孔培养板，待细胞单层融合后用于后续实验，实验设正常培养组、基质组及石菖蒲挥发油组。石菖蒲挥发油组：终浓度为60、80、100、120、140、160、180及200 mg/L的石菖蒲挥发油，与心肌细胞作用24 h备用；基质组于细胞贴壁生长24 h时吸弃原培养基，PBS 冲洗3次加入人工缺氧液100 μL置于含94% N2、1% O2、5% CO2的三气培养箱中培养90 min，吸弃缺氧液、加入DMEM高糖培养基、于正常培养箱中培养90 min备用；正常培养组吸弃原培养基加入DMEM高糖培养基，置于正常培养箱中培养90 min备用。MTT法为在96孔板中每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱4 h，吸去上清液后加入DMSO溶液裂解150 μL，避光下低速振荡10 min使化合物溶解。用酶标仪测定光密度(OD)值，测定波长为570 nm，每组设置6个重复样品孔，重复3次，取平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 石菖蒲挥发油中醚类、酚类及烯类化学成分和相对类含量

石菖蒲挥发油主要含有醚类、酚类、烯类、醇类、萜类、素类、醛类及胺类化学成分。醚类和酚类所占比例最高，主要包括甲基乙丁香酚、甲基异丁香酚、异丁香粉甲醚、α-细辛醚、β-细辛醚等成分，占挥发油总量的95.78%；β-细辛醚含量最高、占挥发油的54.75%；其次为α-细辛醚、异丁香粉甲醚、甲基异丁香酚及甲基乙丁香酚，分别占挥发油的32.18%、2.27%、1.73%及1.60%。见表1。

表1 石菖蒲挥发油中醚类、酚类、烯类醇类、萜类、素类、醛类及胺类等化学成分含量Tab.1 Chemical constituents and relative contents of ethers, phenolsalkenes alcohols, terpenoids, aldehydes ,and amines in volatile oil of acorus gramineus

2.2 石菖蒲挥发油对正常心肌细胞形态和活力的影响

基质组与正常培养组心肌细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与基质组比较， 60～180 mg/L的石菖蒲挥发油组心肌细胞存活率升高，而200 mg/L石菖蒲挥发油组心肌细胞存活率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 石菖蒲挥发油对心肌细胞活力的影响Tab.2 Effect of volatile oil of acorus gramineus on activity of cardiomyocytes

3 讨论

石菖蒲生于山谷、山涧和泉流的水石中，呈扁平圆柱形，表面褐色、棕红色或灰黄色，粗糙，多节。辛、苦，性温，归心、肝及脾，胃经，具有健胃祛风、活血止痛、醒神益智、消肿及解毒等功效[8-11]。药理研究表明，石菖蒲具有镇静、抗惊厥作用，在一定浓度下可增加冠状动脉流量，扩张冠状血管，具有镇静、改善消化功能、平喘、止咳等作用；且对人体的中枢神经系统有抑制作用，能够镇静、安神、催眠；又有着芳香化浊、祛痰湿的作用[12-13]。内饮能促进消化液分泌，抑制胃肠异常发酵，缓解肠平滑肌痉挛；此外还能抵抗组胺引起的支气管收缩，用于临床治疗癫痫等神经系统疾病，疗效良好，且可用于湿阻中焦、胸闷腹胀、胃口不佳、舌苔黄腻等症状，常与砂仁、厚朴、苍术等化湿、行气止痛的药物同用，起到湿浊中阻、湿热泻痢的作用[14-15]。临床常用于消化不良、胸腹胀满、癫狂、痈疖肿痛等。近年来研究显示，挥发油是石菖蒲镇静、睡眠及抗惊厥主要有效部位[16]。石菖蒲中挥发油气味清香，能有效促进消化液的分泌，抑制胃肠的异常发酵，能醒脾、醒胃消化，且对一些神经系统动物模型具有重要的生理活性[17-18]。故本研究测定石菖蒲挥发油中成分及含量，为合理用药提供依据。从中药挥发油的提取方法包括蒸汽蒸馏、溶剂萃取法、按法、微波萃取法、超声波提取法、超临界流体萃取法等，因蒸汽蒸馏设备简单、操作简单和低成本，常用于是挥发油提取，但在提取过程中，油和水的乳化和分离困难是常见的问题，导致挥发油的提取率低，质量差[19-20]。因此，从化学成分的角度探讨挥发油的乳化机理，为开发挥发油破乳技术提供理论依据，在工业生产中，对高挥发油的收率和质量具有十分重要的意义。常用测定方法为GC-MS，GC-MS是将气相色谱和质谱仪结合并借助计算机进行分析，因其具有GC的高分辨率和MS的高灵敏度，能够同时获取样品成分种类和含量分布信息，并以图像的形式反映分布情况[5-6]。

有报道显示，不同地区石菖蒲挥发油中成分含量不同，会结果产生一定影响[21-22]。而本研究中采用粉末配置，使结果更准确，结果显示，在石菖蒲挥发性成分研究中，共检出35个化合物，包括醚类、酚类、烯类、醇类、萜类、素类、醛类及胺类化学成分，其中对醚类和酚类所占比例最高，主要包括甲基乙丁香酚、甲基异丁香酚、异丁香粉甲醚、α-细辛醚、β-细辛醚等成分，占挥发油总量的占挥发油总量的95.78%，石菖蒲挥发油主要含有甲基乙丁香酚、甲基异丁香酚、异丁香粉甲醚、α-细辛醚、β-细辛醚等成分，其中β-细辛醚含量最高，占挥发油的54.75%，其次为α-细辛醚、异丁香粉甲醚、甲基异丁香酚及甲基乙丁香酚，分别占挥发油的32.18%、2.27%、1.73%及1.60%。与吴启端[23]、张莉等[24]报道一致，说明β-细辛醚为石菖蒲主要活性成分，其水煎剂可缓解胃肠平滑肌痉挛，促进消化液分泌，停止胃肠异常发酵[25]。同时宁百乐等[26]研究显示，石菖蒲挥发油具有兴奋、抗抑郁、抗缺氧、镇静、催眠及抗惊厥作用。因此本研究认为临床可考虑采用石菖蒲挥发油代替石菖蒲材料。同时本研究还分析了这些挥发油成分对心肌细胞活力的影响，结果显示，基质组与正常培养组细胞存活率比较差异无统计学意义，表明本实验所用基质浓度对正常心肌细胞活力无影响，而与基质组比较，浓度为60～180 mg/L的石菖蒲挥发油组细胞存活率升高，浓度为200 mg/L的石菖蒲挥发油组细胞存活率降低，表明该浓度范围为60～180 mg/L的石菖蒲挥发油可提高正常心肌细胞活力。

综上所述，β-细辛醚为石菖蒲挥发油主要活性成分之一，可提高正常心肌细胞活力，因此建议考虑采用石菖蒲挥发油代替石菖蒲材料，但对于不同区域和品种间存在差异有待于进一步研究，以期为临床提供充足论证。