UPLC-ESI-MS/MS法测定苗药隔山消中8个成分含量*

秦兰， 孙佳， 刘春花， 陆苑， 潘洁， 李勇军， 王永林， 林昌虎***

(1.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心 & 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

苗药隔山消又名飞来鹤、过山消及白首乌等，为萝藦科白前属植物耳叶牛皮消[Cynanchumauriculatum (C.auriculatum)Royle ex Wight]的干燥块根，主产于湖南、湖北、四川及贵州等地，始载于宋朝《开宝本草》，现收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)，在我国已有悠久的药用历史[1-5]。根据苗医药理论, 隔山消为和性、属慢经，具有甜、淡的质征，走中关，具有健胃消食、补虚弱及通气催乳的功效，临床主用治胃痛、食积胞胀、小儿疳积、多年老胃病及少乳、虚劳性损伤及痢疾等，在苗族地区应用较广，为常用治疗胃肠疾病的药物[6]。现代研究表明隔山消中主要含有苯乙酮类、甾体苷类、有机酸类、香豆素类及木脂素类等多种化学成分，具有促进胃肠道运动、抗抑郁、抗肿瘤、抗功能性消化不良及保肝等作用[7-10]。《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)中仅对隔山消的性状、鉴别、薄层色谱鉴别、性味、功能主治、用法用量及储藏条件等方面制定了标准，而对其主要成分的含量测定方法暂未制定标准[3]。目前隔山消的研究主要集中在化学成分的分析与分离提取上，而对于化学成分的含量测定报道较少，且主要是对单个指标或同类别化合物进行含量测定，如曹雨等[11]应用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Exactive)技术快速归属和鉴定隔山消抗神经氨酸酶最佳活性部位中的化学成分；谢凯强[12]利用超高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)和核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)对隔山牛皮消、耳叶牛皮消和戟叶牛皮消三种民间称之为“隔山消”的植物中C21-甾体苷元类化学成分进行分析并建立了指纹图谱；孙佳等[13]采用HPLC同时测定隔山消中5个同类成分的含量；肖培云等[14]采用HPLC法测定隔山消中没食子酸的含量。由于中药的化学成分具有复杂性与多样性的特点，在中药有效成分尚不明确的情况下若只采用一个或几个少数指标进行质量评价，不能全面真实反映药材的质量状况。本课题组前期研究中已证明隔山消水溶性部位提取物能促进小鼠胃排空和肠推进，其主要成分为告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸及绿原酸等[15]。因此，为完善隔山消的质量标准，本研究选择上述8个成分作为含量测定的指标成分，并结合超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法(ultra-high-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS)技术的高分辨、高分辨性、高灵敏度、专属性好及检测周期短等特点[16-23]，建立同时测定苗药隔山消中告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸及绿原酸 8 个成分含量的检测分析方法，以期进一步为隔山消的质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1药材来源 13批次隔山消药材购自贵州省、甘肃省、四川省及云南省等地(表1)，经贵州医科大学药学院生药学教研室刘春花副教授鉴定为萝藦科植物耳叶牛皮消(C.auriculatum)的干燥块根。

表1 药材来源Tab.1 Source of medicinal materials

1.1.2主要试剂与仪器 ACQUITY 系统超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和 Masslynx4.1 质谱工作站(美国 Waters 公司)，Allegra 64R 型低温高速离心机(Beckman Coulter 公司)，ZH-2 型涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)，AE240 型十万分之一电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，FL-UP-YZ-20 型超纯水仪(苏州飞鹿环保科技有限公司)，KQ-250E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；标准化合物白首乌二苯酮(由实验室自制，经HPLC检查，用面积归一化法计算，纯度大于98%)，告达亭、松脂素、芹菜素(成都埃法生物科技有限公司，批号AF8071803、AF9052003、AF7061813，纯度均≥98%)，东莨菪内酯、丁香酸、阿魏酸、没食子酸(成都普思生物科技股份有限公司，批号PS010525、PS010564、PS010591、PS000688，纯度均≥98%)，甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，德国Merck 公司)，水为超纯水(四川沃特尔水处理设备有限公司)，其余试剂为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1色谱和质谱条件 色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，保护柱为 Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱(0～0.5 min、90%～85%A，0.5～3.0 min、85%～75%A，3.0～3.2 min、75%～70%A，3.2～4.0 min、70%～68%A；4.0～4.5 min，68%～10%A；4.5～5.0 min，10%A，5.0～5.5 min、90%A)；流速 0.35 mL /min；柱温40 ℃；进样量1 μL。电喷雾电离源(electrospray ionization source，ESI)、去溶剂气(氮气1 000 L/h)及其温度(600 ℃)，碰撞气(氩气50 L/h)，扫描方式为多反应离子监测模式(multiple reaction monitoring，MRM；表2)。

1.2.2供试品和混合对照品溶液的制备 隔山消药材经粉碎(过5号筛)，精密称取2.0 g，置于圆底烧瓶，加70%甲醇25 mL，称定重量，水浴加热回流提取1.5 h，放置室温；再称定重量，70%甲醇补足失重，摇匀、滤过，取续滤液1 mL 置于2 mL 容量瓶，加50%甲醇定容；14 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。分别取1～8 种对照品适量，精密称定，加甲醇溶解、摇匀，配制成质量浓度分别为95.238 1 mg/L(白首乌二苯酮)、23.809 5 mg/L(阿魏酸 )、9.523 8 mg/L(松脂素)、4.761 9 mg/L(没食子酸、丁香酸)、1.904 8 mg/L(东莨菪内酯、告达亭)及0.952 4 mg/L(绿原酸)的混合对照品储备液。

1.2.3专属性考察 取混合对照品溶液及 50%甲醇水空白溶剂按照“1.2.1”项下的液质联用条件进样分析。

1.2.4线性关系及定量限考察 取“1.2.2”项下混合对照品储备液适量，加 50%甲醇水稀释成6个浓度的系列混合对照品溶液，按照“1.2.1”项下的液质联用方法进样分析。以各待测成分质量浓度(X)为横坐标，以检测成分峰面积(Y)为纵坐标，得线性回归方程及相关系数(r)；配制混合对照品溶液，成比例稀释，进样分析，按待测成分信噪比S/N=10计算定量限。

1.2.5精密度考察 取混合对照品溶液，按照“1.2.1”项下的液质联用条件连续进样6 次，测定峰面积，计算8种成分相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)，评估仪器精密度。

1.2.6重复性考察 按照“1.2.2”项下方法制备同一批样品(编号A3)的供试品溶液6 份，按照“1.2.1”下的液质联用条件进样分析，测得各成分峰面积，计算8种成分平均含量及RSD，评估方法重复性。

1.2.7稳定性 取A3样品按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12及24 h 按照“1.2.1”项下的液质联用条件进样检测峰面积，计算8种成分RSD，评估供试品溶液在24 h 内的稳定性。

1.2.8加样回收率 精密称取已知含量的隔山消药材粉末(A3)9 份、1.00 g/份，均分为3 组，根据已知药材含量按比例1.00 ∶0.50、1.00 ∶1.00及1.00 ∶1.50精密加混合对照品溶液，制成低、中、高浓度的质控样品，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定。

1.2.9样品测定 分别取13批隔山消药材，按照“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定。

2 结果

2.1 UPLC-ESI-MS的建立

本研究设定的色谱条件和质谱条件可测得隔山消中8种成分的色谱峰(图1)，隔山消中告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸及绿原酸在一定范围内呈良好线性关系(表3)，8种成分的回收率为95.247%～102.432%，RSD为0.553%～2.590%(表4)，提示本研究建立的方法可用于隔山消中8种成分含量的测定。

混合对照品溶液 供试品溶液 空白溶液注 ：A为告达亭，B为松脂素，C为绿原酸，D为白首乌二苯酮，E为丁香酸，F为阿魏酸，G为东莨菪内酯，H为没食子酸。图1 混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液中8个成分的提取Fig.1 Extracted ion chromatograms of 8 compounds in mix-reference solutio,test solution , and blank solution

表3 隔山消8种成分的回归曲线方程及定量限Tab.3 Regression equation and quantitation limits of 8 components

表4 隔山消8种成分回收率试验结果Tab.4 Results of recovery rate tests of 8 components in radix cynanchi

2.2 精密度试验、重复性试验及稳定性试验

精密度试验中，告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸及绿原酸的峰面积RSD分别为1.14%、0.84%、0.59%、1.09%、0.81%、1.36%、0.42%及0.63%，表明仪器精密度良好；重复性试验中告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸、绿原酸的平均含量分别为 1.33、11.76、130.82、4.64、0.19、4.10、3.16及18.17 μg/g，RSD分别为 2.02%、2.14%、2.35%、1.92%、1.30%、1.40%、1.64%及2.13%，表明方法重复性良好；稳定性试验中，告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸及绿原酸的峰面积RSD分别为 0.61%、1.44%、0.35%、1.38%、1.76%、1.29%、1.11%及0.62%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.3 隔山消中8种成分含量

不同批次样品间各成分的含量差异较大，同时白首乌二苯酮的含量最高，松脂素、阿魏酸和绿原酸的含量相对较高，其余成分含量较低。见表5。

表5 样品中8种成分含量Tab.5 Determination results of 8 components in samples

3 讨论

隔山消为少数民族地区的传统习用药物，也是中药白首乌的主要品种之一，具有清热解毒、散结行瘀、生肌止痛、消食的功效，可治疗刀伤出血、毒疮红肿、隔食饱胀、小儿肺炎及肾炎等[24]。现代研究证实隔山消为健胃药，具有改善肠胃运动、提高消化及摄纳食物功效，主要应用于胃肠疾病的治疗[25]。本实验考察了不同溶剂提取(水、30%甲醇、50%甲醇 、70%甲醇、100%甲醇、30%乙醇、50%乙醇 、70%乙醇及100%乙醇溶液)和不同提取方式(加热回流和超声提取)对隔山消成分提取效果的影响，结果显示用 70%甲醇水溶液回流提取的方式，提取效果最佳；提取时间考察尝试了加热回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0及4.0 h，结果显示回流提取1.5 h的成分峰形较好且提取成分较丰富，因此本研究确定隔山消最佳提取工艺为70%甲醇水溶液回流提取1.5 h。

中药作为一种多疗效多靶点的复杂天然药物，单一成分的含量并不能体现其真实药效[26]。随着色谱技术的发展和仪器性能的提高，多成分含量测定方法已成为中药现代化质量控制的手段和趋势[27]。因此建立一种灵敏、快速及可靠的定量分析方法同时测定隔山消药材中主要成分的含量是极其有必要的。研究前期尝试使用HPLC法测定，但各成分之间分离度低，耗时长，且各成分响应较低，尤其是含量较低的告达亭类和没食子酸类成分，无法实现定量分析，因此考虑选择具有耗时短、选择性高、灵敏度高及专属性好的UPLC-ESI-MS法进行分析。UPLC-ESI-MS/MS技术集分离、定性和定量于一体，可同时对同一样品中多种成分进行检测。因此本研究建立了适当的UPLC-ESI-MS/MS分析方法用于同时测定不同产地隔山消药材中告达亭等8个成分的含量。

本实验在优化色谱条件时本实验在优化色谱条件时，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为流动相的色谱行为，结果表明0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水具有更好的色谱分析效果，基线更加平稳、峰形更加尖锐、分离度也较好，适当酸的加入可以维持样品在流动相中的电离状态，有助于增强各成分的响应，同时可以改善峰型。因此，本实验将0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为流动相系统进行梯度洗脱，实验结果表明不同批次间各成分的含量差异较大，可能与不同采收时间、不同气候及不同地理位置等因素有关；同时白首乌二苯酮的含量最高，松脂素、阿魏酸和绿原酸的含量相对较高，可考虑将这些成分作为隔山消药材质量控制的重要指标性成分。

综上所述，本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同时测定隔山消药材中告达亭、松脂素、白首乌二苯酮、阿魏酸、没食子酸、东莨菪内酯、丁香酸及绿原酸8个成分的含量，该方法简单、快捷，灵敏度高，专属性好，可为隔山消药材的质量控制提供参考依据。